基于网络药理探讨四妙散治疗骨性关节炎的作用机制

朱凯　梁学振　刘金豹　许波　盛韦菖　李刚　

摘要 目的：基于網络药理学探讨四妙散治疗骨性关节炎（OA）的作用机制。方法：从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中检索四妙散中黄柏、苍术、薏苡仁、牛膝的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，通过Uniprot数据库进行靶点预测;通过TTD、Drugbank、CTD、Gencards、OMIM、PharmGKB、GAD、KEGG数据库获取OA的相关靶标，并进一步对药物和疾病靶点相映射得到四妙散治疗OA的潜在靶点，运用Cytoscape和STRING软件构建“中药-成分-靶点”与蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，筛选可能发挥治疗作用的重要成分及靶点，并对相关靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析获知其潜在的作用机制。结果：从四妙散中共筛选出活性成分67个，包括槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、汉黄芩素、非洲防己碱等，与骨关节炎相关的作用靶点524个，包括TNF、IL6、MAPK1、PTGS2、MAPK8等。四妙散主要通过调节TNF信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体、Toll样受体信号通路等发挥治疗骨关节炎的作用。结论：本研究运用网络药理学预测了四妙散治疗OA可能的活性成分、关键靶点及作用通路，体现了中药治疗疾病具有“多成分、多靶点、多途径”的特点，为其药效物质基础和作用机制研究提供了理论基础。

关键词 四妙散;骨性关节炎;活性成分;靶点;网络药理学;作用机制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Simiao Powder in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology.Methods：The active components of Phellodendron Phellodendri，Atractylodes，Coix seed and Achyranthes bidentata in Simiao Powder were retrieved from TCMSP database，screened under the condition of OB≥30%，DL≥0.18，and the target was predicted by Uniprot database.The related targets of osteoarthritis were obtained through the databases of TTD，Drugbank，CTD，Gencards，OMIM，PharmGKB，GAD and KEGG，and the important targets of Simiao Powder in the treatment of osteoarthritis were further mapped by drugs and disease targets.The PPI network of “traditional Chinese medicine-active ingredient-important target” and protein interaction was constructed with Cytoscape and STRING，and the main treating components and key targets were screened.The potential action mechanism of the targets was obtained by GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis.Results：A total of 67 active components were screened from Simiao Powder，including quercetin，stigmasterol，β-sitosterol，wogonin，Tetrandrine，etc，and 524 targets related to osteoarthritis，including TNF，IL6，MAPK1，PTGS2，MAPK8 and so on.Simiao Powder mainly played a role in the treatment of osteoarthritis by regulating signal pathways of TNF，HIF-1，NOD-like receptor，Toll-like receptor.Conclusion：In this study，the possible active components，key targets and pathways of Simiao Powder in the treatment of osteoarthritis were predicted by the method of network pharmacology，which reflects the characteristics of “multi-components，multi-targets and multi-pathways” in the treatment of traditional Chinese medicine.It provides a theoretical foundation for the study of its pharmacodynamic material base and functional mechanism.

Keywords Simiao Powder; Osteoarthritis; Active ingredient; Target; Network Pharmacology; Mechanism of Action

中图分类号：R289.4;R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.006

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种退行性关节疾病，可逐渐影响关节功能。以关节软骨和软骨下骨重建的退行性丢失和异常修复为特征，可以致残，并极大地影响个人生命质量[1]。世界卫生组织（WHO）估计，在60岁及以上的老年群体中，约10%的男性和18%的女性有OA症状，其中80%有活动障碍表现[2]。据预测，到2050年，60岁以上的人口将显著增加，在全球范围内达到20多亿，老年人口的增长将导致全球OA发病率的增加[3]。OA的发生是一个复杂的过程，涉及许多危险因素，如年龄、性别、职业、种族、肥胖、遗传、创伤、炎症、饮食、激素等[4-5]。骨关节炎在临床中常常表现为关节僵硬和间歇性疼痛的轻微症状，关节活动受限和持续剧烈疼痛的严重症状，以及关节不稳定和跛行等更为严重的症状[6]。现代医学治疗早、中期OA多选用氨基葡萄糖、非甾体抗炎药等药物，但常引起上消化道出血及肝肾损害等不良反应[7]，晚期严重者需行关节镜和手术治疗。近年来，中医药对于OA的治疗有较好的疗效，特别是在OA的早、中期，中医药治疗具有明显优势。中医古籍中无“骨性关节炎”一词，但根据其症状及其表现可归属中医学“痹证”“骨痹”范畴。

四妙散出自清代张秉成的《成方便读》一书，该方由黄柏、苍术、薏苡仁、牛膝组成，具有清热利湿、补益肝肾的功效。方中黄柏性味苦寒，善清下焦湿热，苍术燥湿健脾，薏苡仁祛湿热，利筋络，牛膝补肝肾强筋骨，还可加强诸药走入下焦之力。其组方全面严谨，功专效宏，是作为临床治疗湿热痹症的常用方。吴鹏飞[8]研究结果证实四妙散加减能够显著改善膝关节OA患者的临床症状，提高治疗有效率。梅宗志[9]运用四妙散加味治疗观察组膝关节OA患者的有效率高达90.32%，明显改善膝关节的疼痛及活动程度。钟邱等[10]运用四妙散加味联合针灸推拿治疗膝关节OA，疗效显著。

中医药治疗骨关节炎的方法在临床上应用较广泛，且取得了较好的疗效，但中医药临床辨证施治和各种治疗方式的应用与普及，一直缺乏可被接受的科研规范，阻碍中医药疗法成为治疗骨关节炎的主流治疗方法[11]。目前，网络药理学作为一门新兴交叉学科。它构建了“药物-靶向-疾病”的多层网络，利用网络分析观察药物对疾病网络的干预和影响，从而更好地理解药物对疾病的治疗作用[12]。其强调从“一个目标，一种药物”向“网络目标，多组分治疗”的范式转变，具有整体性和系统性特点。而这与中医药的整体思维及中医辨证论治的整体思想相一致[13-15]。基于此，本研究通过网络药理学挖掘分析四妙散治疗OA的活性成分及作用靶点，并为其作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库 分析软件使用Cytoscape 3.7.2，所用数据库名称及其网址见表1[16-26]。

1.2 药活性成分及药物靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），分别输入黄柏、苍术、牛膝、薏苡仁4味中药的名称，搜索获取活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，汇总活性成分，并检索对应的靶标蛋白。利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）查询靶标蛋白所对应的基因名称，对重复的靶点进行删除，加以汇总。

1.3 疾病相关靶点的检索 通过TTD、Drugbank、CTD、Gencards、OMIM、PharmGKB、GAD、KEGG数据库分别以疾病名称“Osteoarthritis”进行检索，根据不同的筛选条件总结归纳，进而得到OA的相关靶点。将中药活性成分的作用靶点与OA疾病靶点交互映射，以获取潜在靶点。

1.4 中药-活性成分-靶点网络图的构建 将四妙散4味中药的名称、主要活性成分及其靶点的相关数据导入至Cytoscape 3.7.2软件以绘制中药-活性成分-靶点网络图。

1.5 建潜在靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络 将四妙散作用于OA的潜在靶点导入STRING数据库，设置蛋白质种类为“homo sapiens”，其他参数默认，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络模型，其中自由度（Degree）表示与该节点直接连接的节点数目。利用Cytoscape 3.7.2进行网絡拓扑属性分析，以筛选出四妙散治疗OA的关键靶点。在STRING数据库中导入33个潜在靶点以绘制PPI网络图。图中圆点代表靶点，若颜色越深，形状越大，则代表该节点与其他节点之间的连线越多，关系越密切。

1.6 基因本体（GO）富集分析与京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析 DAVID数据库作为一种基因注释工具，可充分发掘基因与疾病间的相关性，并对相关基因进行富集分析[26]。利用该数据库对四妙散治疗OA的潜在靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，找出其关键通路。

2 结果

2.1 中药活性成分及药物靶点的筛选结果 共检索到四妙散中黄柏、苍术、薏苡仁、牛膝的活性成分分别为140、49、38、176个，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，共获取活性成分67个，其中黄柏38个，苍术9个，薏苡仁9个，牛膝21个。靶点预测发现，黄柏736个、苍术68个、薏苡仁87个、牛膝444个，去除重复靶点后共获得84个。

2.2 OA相关靶点检索结果 通过TTD、Drugbank、CTD、Gencards、OMIM、PharmGKB、GAD、KEGG数据库分别检索到10、14、384、76、65、1、63、2个靶点，合并及删除重复靶点后共获得524个重要靶点。

2.3 中药-活性成分-靶点网络构建结果 将四妙散活性成分靶点与OA靶点进行映射，获得四妙散治疗OA的33个潜在靶点，以韦恩图的形式展示。见图1。通过Cytoscape 3.7.2软件构建中药-活性成分-靶点网络图，从中可见该网络共有155个节点，包括4个药物、67个活性成分及84个靶点节点，共有1 384条边。Degree值前10位的活性成分主要有MOL000098（槲皮素）、MOL000449（豆甾醇）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000173（汉黄芩素）、MOL000785（非洲防己碱）等。见表2。此外，每个活性成分平均与20.66个靶点互相作用，而每个靶点平均与15.56个活性成分互相作用。见图2。

2.4 潜在靶点PPI网络的构建结果 共有33个节点，274条边，Degree均值为16.61，其中大于Degree均值的靶点共有15个。见图3。网络中的10个关键节点可能在四妙散治疗OA中发挥着关键作用。见图4。

2.5 GO功能富集及KEGG信号通路富集分析结果共得到211条GO富集条目（P<0.05），其中包括153个生物过程（Biological Processes，BP）、20类细胞组分（Cell Components，CC）和38种细胞功能（Molecular Function，MF）。BP主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、信号转导、转录调控、凋亡过程、基因表达等;CC方面，在胞质核周区、线粒体、核质、胞外区、质膜基因富集占比较高;MF方面主要富集在血红素结合、类固醇激素受体活性、蛋白质同二聚体活性、序列特异性DNA结合、转录活性等。见图5。

共富集到与OA相关的KEGG信号通路79条，其中P<0.05的信号通路共有70条。其中主要显著在癌症途径、TNF信号通路、恰加斯病、甲型流感、利什曼病、百日咳、沙门菌感染、破骨细胞分化、类风湿性关节炎通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等。KEGG通路富集前20位（按P值排列）。见图6。气泡图Y轴英文字母代表KEGG通路名称，X轴数字代表基因的百分比，圆圈大小代表富集的基因个数，颜色代表-Log10 P值，其与富集的程度正相关。

3 讨论

OA是一种以关节软骨退化、骨赘形成、滑膜增生、软骨下骨囊肿和硬化为特征的退行性关节疾病，是导致老年人群关节疼痛和功能障碍的主要原因之一[27]。流行病学研究表明，55岁和65岁患者的OA发病率分别为44%～70%和60%～70%[28]。尽管OA的患病率很高，但其发病机制仍不明确。OA在中医古籍中未提及，但根据其症状及表现，将其归于中医“痹证”“骨痹”的范畴。中医认为人至中年，肝肾亏虚，筋骨肌肉渐失濡养，寒湿之邪易乘虚而入，滞于筋脉关节，引起关节肿痛，寒湿日久郁而化热，进而形成湿热痹证。故肝肾亏虚是痹证的基本病机，清热利湿更应首当其冲，补益肝肾亦不可加重湿热，因此当以清热利湿为主兼顾补益肝肾[10]。而四妙散可清热利湿，补益肝肾，是临床治疗湿热痹症常用方，已广泛应用证属湿热痹症的关节疾病。

本研究初步筛选出四妙散中67个重要活性成分，检索到四妙散治疗骨关节炎84个重要靶点，绘制出中药-活性成分-靶点网络图，结果显示节点度值较高的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇等。其中槲皮素是一种天然黄酮类化合物，在抑制炎症介质生成、影响炎症相关信号通路以及抑制ECM降解等方面起到保护关节软骨的作用，以延缓OA的发展[29]。豆甾醇、β-谷甾醇皆属于植物甾醇，Chen等[30]研究发现豆甾醇在抑制基质金属蛋白酶表达方面具有重要作用，能减少软骨的降解，具备治疗OA的潜力。Choi等[31]研究发现β-谷甾醇可明显抑制NO的合成，减弱巨噬细胞IL-6的活性，从而减少TNF、IL-1等炎症介质的分泌而发挥其抗炎作用。四妙散治疗OA的PPI网络图显示共有33个靶点蛋白，通过网络拓扑分析得到的关键靶点包括TNF、IL6、MAPK1、PTGS2、MAPK8等。有研究证实TNF在关节滑膜炎性病变及软骨基质的降解过程中起重要作用[32]。IL6作为炎症介质，通过促进细胞外基质更新的速度，进而加快关节软骨细胞退化和凋亡[33]。MAPK1、MAPK8同属于丝裂原活化蛋白激酶家族，有研究表明MAPK途径是介导OA软骨损伤极为重要的信号转导系统，其主要机制是利用关节炎的特异性炎症介质、生长因子等与细胞膜受体结合，以激活细胞内MAPKs信号通路，引起相关反应，例如MMPs表达增加、软骨细胞凋亡、软骨破坏等[34]。PTGS2是一种较为典型的炎症反应基因，在OA的发病机制中具有一定作用，有研究发现抑制T型VGCCs可通过降低PTGS2的表达来减弱软骨细胞的OA样表型[35]。

GO富集分析结果表明，四妙散治疗OA主要通过转录调控、细胞凋亡、信号转导，基因表达等生物过程实现的。KEGG信号通路结果显示，四妙散主要通过干预炎症反应、细胞周期、破骨细胞分化等通路治疗OA。与炎症相关的通路主要是TNF信号通路及NOD样受体信号通路。TNF是一种细胞因子，可与细胞膜上特异性受体结合，从而发挥促进细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症的作用[36]。有研究发现TNF-α可通过促进滑膜炎症和激活软骨细胞及滑膜成纤维细胞参与OA的发病机制[37]。在NOD样受体信号通路中，NOD样受体作为一种模式识别受体，在自身免疫反应起始阶段发挥重要作用，在受到刺激后活化，通过激活Caspase-1蛋白促进细胞的死亡以及炎症反应，从而进一步激活MAPK途径，影响软骨细胞内基因的转录及修饰，最终导致关节基质的降解和关节炎症[38]。干预细胞周期相关的HIF-1通路，在骨发育、再生与成骨结合过程中起着至关重要的作用，可介导软骨细胞对缺氧的反应，促进细胞外基质合成和抑制凋亡，在软骨内稳中起关键作用[39]。Toll样受体（TLRs）是一類天然免疫受体，在软骨细胞中可表达，其中TLR4是最主要受体，在OA的进展中具有重要作用[40]，钱臣和卞晓星[41]发现TLR4的表达活化与软骨细胞的凋亡有密切联系。此外，其他显著性较高的通路，如癌症通路、美洲锥虫病等通路也可能成为四妙散治疗OA的重要通路，但相关文献较少，仍待进一步探索，可能成为今后研究的重点。

本研究为开展四妙散的临床应用和科学研究提供了重要参考，证明了四妙散中多种成分可以作用于同一靶点，一种成分同样可以通过不同靶点起作用，充分体现了四妙散治疗OA具有“多成分、多靶点、多通路”的特点。但是四妙散成分多样、作用机制复杂，本研究仅通过数据库的检索来分析四妙散治疗OA的活性成分及可能作用机制，尚未进行进一步的实验验证，具有一定局限性，而后仍需大量的临床及实验研究证实。

参考文献

[1]Charlier E，Deroyer C，Ciregia F，et al.Chondrocyte dedifferentiation and osteoarthritis（OA）[J].Biochem Pharmacol，2019，165：49-65.

[2]Gao SG，Li KH，Zeng KB，et al.Elevated osteopontin level of synovial fluid and articular cartilage is associated with disease severity in knee osteoarthritis patients[J].Osteoarthritis Cartilage，2010，18（1）：82-87.

[3]Richardson SM，Kalamegam G，Pushparaj PN，et al.Mesenchymal stem cells in regenerative medicine：Focus on articular cartilage and intervertebral disc regeneration[J].Methods，2016，99：69-80.

[4]Hawker GA.Osteoarthritis is a serious disease[J].Clin Exp Rheumatol，2019，37 Suppl 120（5）：3-6.

[5]Bae JY，Park KS，Seon JK，et al.Biomechanical analysis of the effects of medial meniscectomy on degenerative osteoarthritis[J].Med Biol Eng Comput，2012，50（1）：53-60.

[6]王璐，徐颖，刘春芳，等.基于网络药理学探讨盘龙七片治疗骨性关节炎配伍的合理性[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（18）：166-174.

[7]何海军，王荣田，陈卫衡，等.健脾通络方治疗发作期髋骨关节炎的临床研究[J].中国中医骨伤科杂志，2017，25（1）：9-13.

[8]吴鹏飞.四妙散加减治疗膝关节骨性关节炎的疗效观察[J].世界最新医学信息文摘，2016，16（A4）：180.

[9]梅宗志.四妙散加减联合中药奄包治疗膝关节骨性关节炎湿热痹阻型的临床疗效观察[J].四川中医，2015，33（8）：135-137.

[10]赵海玲，周宗波，李建强，等.当归拈痛汤加减内服外洗治疗膝骨性关节炎风湿热痹证的临床观察[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（13）：105-110.

[11]陈卫衡.探索建立系统的膝骨关节炎中医临床科研范式和理论体系[J].中医正骨，2015，27（7）：1-3，5.

[12]世界中医药学会联合会.网络药理学评价方法指南[J].世界中医药，2021，16（4）：527-532.

[13]刘志华，孙晓波.网络药理学：中医药现代化的新机遇[J].药学学报，2012，47（6）：696-703.

[14]张彦琼，李梢.网络药理学与中医药现代研究的若干进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2015，29（6）：883-892.

[15]劉艾林，杜冠华.网络药理学：药物发现的新思想[J].药学学报，2010，45（12）：1472-1477.

[16]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[17]Zhu F，Han B，Kumar P，et al.Update of TTD：Therapeutic Target Database[J].Nucleic Acids Res，2010，38（Database issue）：D787-D791.

[18]Law V，Knox C，Djoumbou Y，et al.DrugBank 4.0：shedding new light on drug metabolism[J].Nucleic Acids Res，2014，42（Database issue）：D1091-D1097.

[19]Davis AP，Grondin CJ，Johnson RJ，et al.The Comparative Toxicogenomics Database：update 2019[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D948-D954.

[20]Yang S，Zhang J，Yan Y，et al.Network Pharmacology-Based Strategy to Investigate the Pharmacologic Mechanisms of Atractylodes macrocephala Koidz.for the Treatment of Chronic Gastritis[J].Front Pharmacol，2019，10：1629.

[21]Hamosh A，Scott AF，Amberger J，et al.Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），a knowledgebase of human genes and genetic disorders[J].Nucleic Acids Res，2002，30（1）：52-55.

[22]Whirl-Carrillo M，McDonagh EM，Hebert JM，et al.Pharmacogenomics knowledge for personalized medicine[J].Clin Pharmacol Ther，2012，92（4）：414-417.

[23]Minoshima S，Ohtsubo M，Shimizu N.[Databases for mutations in human diseases][J].Nihon Rinsho，2010，68 Suppl 8：150-158.

[24]Kanehisa M，Sato Y，Furumichi M，et al.New approach for understanding genome variations in KEGG[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D590-D595.

[25]Szklarczyk D，Morris JH，Cook H，et al.The STRING database in 2017：quality-controlled protein-protein association networks，made broadly accessible[J].Nucleic Acids Res，2017，45（D1）：D362-D368.

[26]Chen Q，Hu J，Deng J，et al.Bioinformatics Analysis Identified Key Molecular Changes in Bladder Cancer Development and Recurrence[J].Biomed Res Int，2019，2019：3917982.

[27]Neogi T.The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21（9）：1145-1153.

[28]Heijink A，Vanhees M，van den Ende K，et al.Biomechanical considerations in the pathogenesis of osteoarthritis of the elbow[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2016，24（7）：2313-2318.

[29]于维汉，何耀华.槲皮素在治疗骨关节炎中作用机制的研究进展[J].中华骨与关节外科杂志，2019，12（6）：477-480.

[30]Chen WP，Yu C，Hu PF，et al.Stigmasterol blocks cartilage degradation in rabbit model of osteoarthritis[J].Acta Biochim Pol，2012，59（4）：537-541.

[31]Choi JN，Choi YH，Lee JM，et al.Anti-inflammatory effects of β-sitosterol-β-D-glucoside from Trachelospermum jasminoides（Apocynaceae） in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 murine macrophages[J].Nat Prod Res，2012，26（24）：2340-2343.

[32]任紅革，崔逢德.细胞因子在骨性关节炎中的表达与应用[J].中国组织工程研究，2012，16（52）：9828-9835.

[33]钟阳，满城.炎症在颞下颌关节骨关节炎发病机制中的研究进展[J].新疆医学，2021，51（4）：455-457，454.

[34]Huang H，Zheng J，Shen N，et al.Identification of pathways and genes associated with synovitis in osteoarthritis using bioinformatics analyses[J].Sci Rep，2018，8（1）：10050.

[35]Lv M，Zhou Y，Polson SW，et al.Identification of Chondrocyte Genes and Signaling Pathways in Response to Acute Joint Inflammation[J].Sci Rep，2019，9（1）：93.

[36]Zhao Y，Li Y，Qu R，et al.Cortistatin binds to TNF-α receptors and protects against osteoarthritis[J].EBioMedicine，2019，41：556-570.

[37]Singh A，Peppas NA.Hydrogels and scaffolds for immunomodulation[J].Adv Mater，2014，26（38）：6530-6541.

[38]李维萍，黄强，豆敏.全膝关节置换术后康复治疗的研究进展[J].中国医药，2020，15（3）：473-476.

[39]Fernández-Torres J，Martínez-Nava GA，Gutiérrez-Ruíz MC，et al.Role of HIF-1α signaling pathway in osteoarthritis：a systematic review[J].Rev Bras Reumatol Engl Ed，2017，57（2）：162-173.

[40]Reuven EM，Fink A，Shai Y.Regulation of innate immune responses by transmembrane interactions：lessons from the TLR family[J].Biochim Biophys Acta，2014，1838（6）：1586-1593.

[41]钱臣，卞晓星.Toll样受体4表达与膝骨关节炎软骨细胞凋亡的关系[J].江苏大学学报：医学版，2015，25（2）：128-132.

（2020-10-18收稿 责任编辑：杨觉雄）