3例犬皮肤肥大细胞瘤病理学及c-kit免疫组织化学染色研究
2021-10-30谢腾熠石俊超徐荣艺贺文琦陆慧君吉林大学动物医学学院吉林长春130062
马 莹,谢腾熠,张 竞,石俊超,高 蕊,徐荣艺,贺文琦,高 丰,陆慧君 (吉林大学 动物医学学院,吉林 长春 130062)
随着生活水平的不断提高和人们对犬猫等动物亲近感的提升,伴侣动物逐渐成为家庭的重要成员;同时蓬勃发展的动物诊疗技术,也提高了伴侣动物的生活质量及寿命。但动物进入老年后,罹患肿瘤的风险也随之增加,因此对于宠物各种肿瘤的精确诊断也愈加重要。肿瘤诊断不仅可对宠物的临床治疗方案及处置方式提供指导,而且也会为动物主人提供一个宠物健康状态的心理预期[1]。
皮肤型肥大细胞瘤(cMCT)是犬发生率较高的皮肤肿瘤之一。cMCT起源于真皮和皮下组织的肥大细胞,占所有皮肤肿瘤的16%~21%,其恶性率可达19%~39%[2]。病理组织学检查是肿瘤诊断的金标准,绝大多数cMCT可以通过苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及甲苯胺蓝(toluidine blue,T-blue)或吉姆萨(Giemsa)等组织化学染色获得诊断,但对于分化程度较差的cMCT,很难通过这些常规的染色技术确诊;此外,cMCT和其他类型的皮肤圆形细胞瘤有一定的相似性,病理诊断时需要相互鉴别,诊断难度较大[3]。
近年来,免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)作为精确诊断小动物肿瘤的一种重要的方法已经在欧美等国家普遍应用,但在我国由于多种限制因素还未发展起来。最新研究表明,c-kit可作为低分化cMCT的特异性分子标记,在常规组织化学染色检查基础上,可为cMCT的精准诊断提供更为确凿的证据;同时,KIT蛋白的不同表达模式与预后具有一定的相关性[4]。因此,本研究联合应用HE染色、T-blue组织化学染色以及c-kit免疫组织化学染色方法,对3例临床疑似犬cMCT进行系统的病理组织学观察分析并作出确诊,不仅为本次肿瘤病例的治疗和预后提供精准指导,而且可为兽医临床各种分化程度的MCT诊、治、防及预后分析等提供参考。
1 材料与方法
1.1 病例基本情况
1.1.1病例1 巴哥犬,5岁,雄性已去势。本次就诊的2个月前,曾在右前肢、左后肢和右侧尾根发生过肥大细胞瘤,病理结果显示为2级,分化良好(其他医院诊断结果);之后在左腹皮肤表面发现一小凸起(图1A),细胞学检测怀疑为肥大细胞瘤。
1.1.2病例2 比熊犬,6岁,雌性已绝育。约2个月前发现右后肢膝关节有1个高粱米粒大小的红点,最近变大凸起(图1B),有舔舐肿块行为。
1.1.3病例3 贵宾犬,5岁,雄性已去势。约4年前发现左侧胸壁一处有米粒大小的肿物,后期逐渐生长变大,经常瘙痒抓挠,与皮下有连接(图1C)。
A.病例1病灶照片;B.病例2病灶照片;C.病例3病灶照片图1 临床病例的病灶外观
1.2 试剂及仪器
1.2.1试剂 甲醛、乙醇、二甲苯购于国药集团化学试剂有限公司;中性树胶(G8590)、甲苯胺蓝(G3668)购于北京索莱宝科技有限公司;伊红(G1101)、苏木素(G1104)购于武汉塞维尔生物科技有限公司;c-kit抗体(ab32363)购于Abcam公司;免疫组化试剂盒(KIT-9710)、DAB显色液(MAX-001)购于福州迈新生物技术开发有限公司。
1.2.2仪器 包埋机(KD-BM,科迪),切片机(RM2245,Leica),切片扫描仪(Panoramic 250/MIDI,3D HISTECH)。
1.3 病理组织切片制作与HE染色
1.3.1固定 将送检组织置于10%中性福尔马林溶液中,固定至少24 h。
1.3.2石蜡切片制作 将组织依次进行酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋;将包埋好的蜡块固定于切片机,切片厚度3~5 μm。
1.3.3HE染色与封片 切片经二甲苯脱蜡,并依次用100%,90%,80%无水乙醇复水,放入苏木素染液中染色5 min,用自来水冲洗返蓝,80%酒精短暂脱水后,放入伊红染液中染色3 min;将切片依次放入80%,90%,100%无水乙醇Ⅰ和Ⅱ、二甲苯Ⅰ和Ⅱ,每个步骤3 min,依次进行脱水与透明。将切片从二甲苯中捞出,组织表面滴加中性树胶,覆盖载玻片,风干保存。
1.4 甲苯胺蓝染色对切片进行脱蜡、复水后,滴加T-blue染色液,染色5 min后用自来水冲洗,95%乙醇分化,后续步骤按照说明书进行操作。
1.5 免疫组织化学染色(c-kit)对切片进行脱蜡、复水后,在枸橼酸钠缓冲液中煮沸20 min进行抗原修复,滴加内源性过氧化物酶阻断剂,PBST冲洗后使用正常动物非免疫血清进行封闭,c-kit抗体做为一抗4℃孵育过夜,PBST冲洗后滴加生物素标记的二抗,PBST冲洗3次后滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶,PBST冲洗3次,滴加DAB显色液进行显色,自来水冲洗终止显色后,用苏木素进行复染。
2 结果
2.1 大体病变病例1切除肿块大小为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,福尔马林固定后表面呈灰黑色(图2A);病例2切除肿块大小0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm,皮肤颜色正常,切开皮下有黄色胶冻样物质(图2B);病例3切除物块大小3 cm×3 cm×0.5 cm,肿块处无毛,较正常皮肤稍红,固定后颜色发白,切面呈灰白色(图2C)。
A.病例1切除肿块;B.病例2切除肿块;C.病例3切除肿块图2 肿块大体病变
2.2 HE染色结果低倍镜下,可见肿块均位于真皮层,无包膜包被,但与周围组织界限清楚。肿块内部可见大量增生的嗜碱性深染的肿瘤细胞,这些肿瘤细胞或呈片状致密分布(图3A),或零星的散布排列在嗜碱性的黏液样物质中(图3B),或呈条索状或小梁状排列(图3C)。周围正常组织因受到肿物压迫而发生变形,肿物边缘部分区域有发生出血及炎性细胞的浸润。高倍镜下,观察到肿瘤细胞为圆形,胞质呈蓝灰色,核呈圆形位于中央,部分肿瘤细胞形态类似于“煎荷包蛋样”外观,细胞异型性较低,未见有丝分裂相(图3D)。有些区域可见嗜酸粒细胞聚集及胶原纤维溶解形成“火焰状”外观(图3E,F)。从病理切片可见病例1和病例3手术边缘较为完整,未见有散在的肿瘤细胞,肿瘤切除干净;病例2手术边缘处仍可见散在的肿瘤细胞,不排除复发的可能性。
A.深染的肿瘤细胞呈片状排列;B.散在分布的肿瘤细胞;C.条索状分布的肿瘤细胞;D.肿瘤区域部分肿瘤细胞呈现“煎蛋样”形态特征;E.肿瘤区域嗜酸粒细胞聚集;F.肿瘤区域内可见部分胶原纤维溶解图3 组织切片HE染色结果
2.3 T-blue染色结果组织切片经T-blue染色后,镜下观察可见肿瘤细胞胞质内颗粒物质呈强阳性反应,表现为蓝紫色(图4A,B,C)。
A.病例1组织切片;B.病例2组织切片;C.病例3组织切片图4 组织切片T-blue染色结果
2.4 c-kit免疫组织化学染色结果3个病例样本中的肿瘤细胞c-kit染色均呈阳性。病例1 c-kit阳性信号多为膜周标记(图5A);病例2多为胞内点状或斑块状标记,可见小部分聚集性弥漫性标记(图5B);病例3 c-kit阳性信号以胞质弥漫性标记为主(图5C)。
2.5 病理诊断根据HE染色和T-blue染色的结果,3个病例的肿瘤组织中均可见有“煎蛋样”的肿瘤细胞形态及胞质颗粒蓝紫色的着色反应,同时见有胶原纤维溶解和嗜酸粒细胞浸润的反应,符合MCT的形态学特征。进一步结合c-kit免疫组织化学染色的结果综合分析,确定3个病例均属于cMCT。其中,病例1和病例2的肿瘤细胞分化良好,属于low grade(two tier system)[5]或grade Ⅰ (three tier system)[6],病例3的肿瘤细胞属于中等程度分化,可分级为low grade(two tier system)或grade Ⅱ(three tier system)。
A.病例1组织切片;B.病例2组织切片;C.病例3组织切片图5 送检组织切片c-kit免疫组织化学染色结果
3 讨论
MCT可发生在犬身体的多个部位,最常见的是皮肤,其次是皮下;不同品种的犬都可发生,拳师犬、哈巴狗、波士顿犬的发生率更高。根据大量的统计资料分析,MCT尚无性别或年龄的相关性,但cMCT的发生率会随着年龄的增长而增加,平均好发年龄为9岁[7],但也曾有2周龄的幼犬发生cMCT的相关病例报告。
病例1肿物的表面颜色呈灰黑色,提示其组织内可能有出血现象,这一推测已通过组织学切片分析结果证实;病例2肿物的中间存在黄色胶冻样渗出物,显微镜下观察证实其为嗜碱性的黏液样物质。经HE染色的病理组织切片分析,确定3个病例的肿块均位于真皮中;肿块区域内的细胞呈卵圆形,体积较大,呈现散在、条索状或片状的排列方式;胞浆内可见大量的嗜碱性颗粒;细胞核呈圆形或椭圆形。这些大量增生的细胞形态符合圆形细胞特征,初步认为是肥大细胞。部分肿瘤区域可见嗜酸粒细胞聚集及胶原纤维溶解,推测可能与临床检查中按压触诊导致肥大细胞脱颗粒,释放组胺等炎性物质有关。
兽医临床中,常常采取操作方便、快捷的细针穿刺抽吸方法进行细胞学检查来诊断犬MCT。但细胞学检查对肥大细胞辨识度比较低,容易造成误诊,而且对于肿瘤细胞的分化程度、MCT病理分级以及肿瘤切除的完整性均无法准确判断。因此,病理组织学分析在MCT诊断中仍是公认的最精确全面的诊断方法。但是,cMCT可能与好发于皮肤的髓外浆细胞瘤、组织细胞瘤等其他类型的圆形细胞瘤具有相似的病理特征,当部分细胞的形态特征不够典型时,很难通过HE染色进行诊断[8]。为进一步确定肿瘤细胞类型,本试验进行了T-blue染色。可见肿瘤细胞胞浆内含有大量着染蓝紫色的均一性颗粒,符合肥大细胞的着色特征;组织中的其他细胞则呈现均匀淡蓝色的阴性着色,故可排除其他圆形细胞瘤的可能,诊断为cMCT[1]。
用于犬的MCT的病理分级体系主要有两种。最早是PATNAIK等[5]和BOSTOCK[9]提出的Patnaik分级体系(three tier system),该体系将cMCT分为3种,分别为分化良好(GradeⅠ)、中等程度分化(GradeⅡ)和分化较差(Grade Ⅲ);级别越高,患犬存活时间越短,肿瘤转移和复发率也越高。但是,不同病理学家应用该体系分级的一致性较低,易造成诊断混乱。2011年,KIUPEL等[6]提出了MCT两级分级方法(two tier system),将cMCT分为低等级(low grade)和高等级(high grade)。研究显示,该方案在不同病理学家之间的诊断一致性大于97%,且该分级体系与肿瘤的预后有显著的相关性。因此,专家认为,两级分级体系更适合犬cMCT的分级[10]。本研究依据上述不同的分级体系,对3个病例进行了分级诊断。病例1和病例2中肿瘤细胞分化良好,细胞大小、形态均与正常细胞无明显差异,异型性较低,并且肿瘤区域与正常组织界限清晰,没有出现侵犯正常组织迹象,所以将这两个病例的肿瘤分级归属于gradeⅠ(three tier system)或low grade(two tier system);病例3的肿瘤细胞中等分化,且肿瘤区域与周围组织的界限比较模糊,有侵犯正常组织的现象,分级为grade Ⅱ (three tier system)或low grade (two tier system)。
研究表明,c-kit基因突变在20%~30%的犬MCT发生中起核心作用,甚至可根据该基因的突变情况,选择toceranib、imatinib和masitinib等特异性的靶向药物进行肿瘤的干预治疗[11]。c-kit基因编码酪氨酸激酶跨膜受体(KIT蛋白),基因突变后诱导KIT蛋白持续活化,导致下游信号不受控制,肥大细胞发生不可控的异常增殖,进而引起肿瘤的发生[12-14]。根据KIT蛋白在细胞中的表达特点,可以对术后肿瘤复发与转移的可能性进行评估。KIT蛋白呈膜周(KITⅠ)标记时,一般预后较好,复发或转移可能性较低;而KIT蛋白阳性信号呈胞质点状和斑块状(KITⅡ)或弥漫性(KIT Ⅲ)标记时,一般预后较差,术后存活时间较短,复发及转移的可能性较大[11,15]。本研究中,病例1和2肿瘤细胞KIT蛋白多为KIT Ⅰ和KITⅡ标记,病例3中肿瘤细胞以KIT Ⅲ标记为主。结合HE染色结果,病例1手术边缘完整,肿瘤切除干净,KIT蛋白以KIT Ⅰ标记为主,推测预后良好;病例2的手术边缘仍可见到散在的肿瘤细胞,手术切除不完全,并且KIT蛋白以KIT Ⅱ型标记较多,存在复发的可能性;病例3的肿瘤细胞分化程度中等,c-kit免疫组化染色有较多KIT Ⅲ型标记,推测该病例肿瘤复发及转移的可能性较高。
目前临床上对于犬的MCT,主要有3种治疗方法,即外科手术切除、化疗和放疗。外科手术切除是最常用的治疗方法,肿块边缘2~3 cm是目前认为比较科学的切除范围[1]。对于c-kit基因突变导致的犬MCT,可以选择特异性的靶向药物治疗。对于未明确c-kit突变导致的MCT,可以选择长春花碱(vinblastine,VLB)、泼尼松龙(prednisolone)和洛莫司汀(lomustine)等常规化疗药物。由于放射线疗法可能引起组织胺的释放,在执行之前建议给予固醇类药物。病例1肿瘤病理分级低,KIT蛋白以KIT Ⅰ为主,完整手术切除后应有不错的预后。病例2和病例3肿瘤病理分级较高,KIT蛋白以KIT Ⅱ和KIT Ⅲ为主,因此建议外科手术切除后给予常规的化疗药物配合治疗,进一步可进行c-kit基因的突变分析,选择更加精准的靶向药物治疗。同时,应及时追踪患宠恢复情况。