慢性阻塞性肺疾病合并非小细胞肺癌与EML4-ALK融合基因的关系*

彭洋,李莎莎,王婷

天津市职业病防治院 1中西医结合科，2综合内科(天津 300011)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是临床常见的一种慢性呼吸系统疾病，在我国城市人口十大死因中排位第4，在农村排位第1[1]。同时我国肺癌发病率、病死率均居所有恶性肿瘤首位，其中80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]。大量研究表明，COPD是肺癌发生的危险因素，尽管COPD向肺癌转化的机制尚不明确，但据调查研究显示，肺癌在COPD人群中发病率是正常人群的2～5倍[3]。目前研究推测两种疾病合并存在可能与吸烟、慢性炎症、肺功能下降等多种因素有关[4-5]。因COPD患者原有早期呼吸道症状多，易掩盖肺癌早期症状，导致肺癌误诊、漏诊，导致肺癌确诊时已进入中晚期[6]。棘皮动物微管相关蛋白样4-间变淋巴瘤激酶(microtubule-related protein-like in echinoderms 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)融合基因是由EML4氨基酸末端蛋白和ALK酪氨酸蛋白的胞内区组成，与细胞恶性增殖及癌变有关，在NSCLC发生、发展过程中起重要作用，是NSCLC患者靶向治疗的新靶点，但EML4-ALK与COPD合并NSCLC的关系尚鲜有研究[7]。因此本研究通过免疫组化检测COPD合并NSCLC肺癌组织中EML4-ALK融合基因蛋白的表达，探究其与COPD合并NSCLC发病风险的关系，以期为晚期NSCLC治疗提供新的治疗方案。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2018年10月COPD合并NSCLC患者70例为COPD合并NSCLC组，年龄38～75岁，平均(62.19±11.65)岁，男41例，女29例，体质指数(body mass index，BMI)为(24.05±2.32)kg/m2，有吸烟史者40例；根据组织病理学特征，鳞癌39例，腺癌31例；根据癌症肿瘤最大径大小分为：≥3 cm者22例，<3 cm者48例；根据FIGO TNM分期分为，Ⅰ期+Ⅱ期49例，Ⅲa期21例；根据分化程度分为高分化12例，中低分化58例；根据有无淋巴结转移分为有转移者25例，无转移者45例。另选取同期收治的单纯COPD患者70例为COPD组，年龄39～75岁，平均(61.43±12.35)岁，男39例，女31例，BMI(23.41±2.15)kg/m2，有吸烟史者40例。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。采集手术治疗中肺癌组织及正常肺组织标本，石蜡包埋处理后保存待检。收集患者临床检查资料，本研究经过我院伦理委员会批准通过，患者及家属知情同意并签字。

1.2 纳入标准和排除标准 纳入标准：(1)符合NSCLC[8]和(或)COPD[9]诊断标准；(2)均经胸片、肺功能、细针肺穿刺细胞学、痰细胞学或组织病理学诊断确诊；(3)临床资料完整；(4)自愿配合研究。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)妊娠期妇女或精神障碍无自主生活能力者；(3)合并肺栓塞或哮喘患者；(4)合并严重心、肝、肾等脏器功能障碍者；(5)合并其他传染性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测肺组织中EML4-ALK融合基因蛋白表达 采用免疫组化法检测肺癌及正常肺组织中EML4-ALK融合基因蛋白的水平。石蜡组织切块以4 μm厚度连续切片后置于60℃烤箱60 min，于预热二甲苯溶液中浸泡10 min，重复3次；梯度乙醇浸泡脱水，3%双氧水室温避光灭活内源性过氧化物酶15 min，枸橼酸钠抗原高压修复5 min，添加Anti-EML4-ALK鼠源单克隆抗体(货号：26242，NewEastbio，购自武汉纽斯特生物技术有限公司)，4℃ 孵育过夜，依次添加生物素标记羊抗鼠二抗IgG(货号：B-2752，美国Invitrogen)和DAB显色液，苏木素复染，盐酸酒精短暂分化后，脱水、透明、封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 阳性结果判定 细胞质(膜)或核内呈黄色或棕色颗粒为阳性染色，采用免疫反应积分(immune reactive score，IRS)法进行评分：染色强度(staining intensity，SI)积分，无着色(0分)，淡黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分)；阳性染色细胞百分比(percentage of positive staining cells，PP)积分，阴性为0分，1%≤PP≤10%为1分，11%≤PP≤50%为2分，51%≤PP≤75%为3分，76%≤PP≤100%为4分。IRS =SI×PP，IRS≥3为阳性，IRS<3为阴性。由2名资深病理科医师采用双盲法随机选取5个视野分别对染色结果进行半定量评分，以保证结果的准确性。

1.4 肺功能指标检测 采用日本光电1550P型超声心电图检测肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure，PASP)；检测患者1 s用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)，计算FEV1/FVC。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 与单纯COPD组比较，COPD合并NSCLC组患者PASP水平较高，FEV1、FEV1/FVC水平较低(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者PASP、FEV1及FEV1/FVC比较

2.2 两组患者肺组织中EML4-ALK蛋白表达情况比较 EML4-ALK蛋白定位于细胞质中，呈棕黄色或棕褐色深染。与单纯COPD组比较，COPD合并NSCLC组患者肺癌组织中EML4-ALK蛋白阳性表达率显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 两组患者肺组织中EML4-ALK蛋白表达情况比较 例(%)

2.3 EML4-ALK蛋白表达与COPD合并NSCLC患者的临床病理特征的关系 EML4-ALK蛋白表达与COPD合并NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤最大径、分化程度无关(P>0.05)，与吸烟史、组织学类型、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。见表3。

表3 EML4-ALK蛋白表达与COPD合并NSCLC临床病理特征的关系 例(%)

2.4 logistic回归分析影响COPD合并NSCLC发生的危险因素 本研究将年龄、性别、BMI、吸烟史、FEV1/FVC、COPD、EML4-ALK蛋白表达纳入自变量，以COPD合并NSCLC患者发生为因变量，进行多因素logistic回归分析，结果发现，FEV1/FVC指标降低、吸烟、EML4-ALK蛋白阳性表达是影响COPD合并NSCLC患者发生的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 logistic回归分析影响COPD合并NSCLC发生的危险因素

注：A：单纯COPD组；B：COPD合并NSCLC组图1 两组患者肺癌组织中EML4-ALK蛋白表达情况(SP，×200)

3 讨论

研究报道，吸烟史导致肺癌和COPD发生的共同危险因素，吸烟COPD患者发生肺癌风险是吸烟非COPD患者的4～5倍，而COPD是肺癌围手术期死亡和呼吸系统并发生的主要预测分子[10]。FEV1降低的吸烟者比FEV1正常的吸烟者发生肺癌的概率增加[6]。本研究结果发现，与单纯COPD患者比较，COPD合并NSCLC患者吸烟人数比例、PASP水平较高，FEV1、FEV1/FVC水平较低，提示COPD合并NSCLC患者存在肺功能较单纯COPD患者更低的现象，COPD合并NSCLC发生可能与吸烟史及肺功能下降有关。然而对于严重COPD合并NSCLC患者，目前临床水平不能达到根治性治疗，因此探究其可能分子机制及相关临床病理特征可能对靶向治疗有一定指导意义。

EML4-ALK融合基因最早由Soda等于2007年在NSCLC患者术后标本中检出，EML4和ALK均位于2号染色体，两者反向间隔12个碱基，EML4-ALK经染色体倒位产生。EML4胞外螺旋结构可将EML4-ALK分子激酶区形成稳定二聚体，可活化下游PI3K-AKT、MAPK、JAK-ATAT3等多种信号通络，与细胞恶性增殖及癌变密切相关[11-13]。随着对EML4-ALK融合基因的研究深入发现，EML4-ALK融合基因是NSCLC继表皮生长因子受体(epidermal growth factor recepto，EGFR)基因突变之后被发现的又一突变基因，且对NSCLC针对基因检测精准靶向治疗有重要决策及指导意义[14-15]。研究发现，晚期肺腺癌、腺鳞癌是EML4-ALK基因表达的主要人群，我国NSCLC患者中EML4-ALK基因阳性率约11.6%。王梦等[12]研究报道，EML4-ALK蛋白在NSCLC患者肺癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织，且与性别、吸烟史、病理类型及临床分期有关。吴菡等[16]研究报道，EML4-ALK融合基因在女性、60岁以下非吸烟NSCLC腺癌人群中阳性表达率较高。本研究结果发现，与单纯COPD患者比较，COPD合并NSCLC患者肺癌组织中EML4-ALK蛋白阳性表达率高达11.43%，提示EML4-ALK蛋白阳性表达可能与COPD合并NSCLC发生发展及疾病严重程度有关。

有研究显示，亚裔、女性、不吸烟的肺腺癌患者是EML4-ALK主要突变对象[7]。杨文丽等[17]研究报道，在NSCLC腺癌患者中，EML4-ALK融合蛋白阳性率在性别、年龄、吸烟史、分化程度、临床分期和淋巴结转移方面比较，差异均有统计学意义，而在腺癌的组织类型和肿瘤大小方面比较，差异均无统计学意义。本研究结果发现，COPD合并NSCLC患者肺癌组织中EML4-ALK蛋白阳性表达与患者吸烟史、组织学类型、TNM分期及淋巴结转移有关，与年龄、性别、肿瘤最大径、分化程度无关，与上述研究不完全一致，推测原因可能与样本量选择及样本选择范围不同、肿瘤异质性或检测方法不同等有关，提示EML4-ALK融合蛋白在COPD合并NSCLC发展过程中发挥显著作用，但具体作用机制有待进一步研究。本研究还发现，FEV1/FVC指标降低、吸烟、EML4-ALK蛋白阳性表达是影响COPD合并NSCLC患者发生的危险因素，提示吸烟、肺功能降低、EML4-ALK融合基因阳性突变可能增加COPD合并NSCLC发生风险，检测EML4-ALK融合基因可能对COPD合并NSCLC靶向治疗方案制定有一定指导意义。

综上所述，本研究首次初步探究发现COPD合并NSCLC患者肺癌组织中EML4-ALK蛋白阳性表达率高，与患者吸烟史、组织学类型、TNM分期及淋巴结转移有关，是影响COPD合并NSCLC发生的独立危险因素，可能对COPD合并NSCLC患者临床靶向治疗及预防方案的选取提供一定参考依据。但由于本研究样本量少，存在不足，另关于EML4-ALK融合基因调控COPD合并NSCLC具体机制及相关通路仍不清楚，后期仍需加大样本含量、进一步深入探究。