乌司他丁与内质网分子伴侣免疫球蛋白结合蛋白的分子对接和结合作用*

许嘉豪,陈淑雯,谢珠良,徐铁成,方建斌,朱卓丽,李雄娟△,黄焕森△

1广州医科大学第二临床学院麻醉系(广东广州 510180)；2广州医科大学附属第二医院麻醉科(广东广州 510260)

免疫球蛋白结合蛋白(binding immunoglobulin protein，Bip)广泛表达在细胞内[1-2]，是一种多功能的内质网分子伴侣，作为内质网应激中未折叠蛋白反应的主要调节蛋白，其最重要的功能是依赖ATP结合内质网中新生多肽的疏水性口袋，组织内质网内新生肽聚集，参与蛋白质的正确折叠和转运[3]。目前相关研究发现，乌司他丁在缺血性脑损伤等器官保护中具有重要作用[4]。有研究表明，乌司他丁可降低百草枯中毒模型大鼠海马中Bip的表达量[5]，表明乌司他丁与Bip之间可能存在相互作用。但是目前关于乌司他丁与Bip相互作用关系的研究甚少，且无相关文献报道两者之间分子对接的模拟情况。因此，2019年10月至2020年5月，本研究选用SD大鼠建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，采用酶标仪测定大鼠血清、缺血脑组织中乌司他丁和Bip的浓度，通过乌司他丁与Bip分子的体外结合实验，并使用PyMOL软件及分子模拟软件构建乌司他丁与Bip分子对接情况进行分析，探讨乌司他丁与Bip的相互作用，为进一步明确乌司他丁在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠36只，由南方医科大学实验动物中心提供，体重220～250 g。随机分为正常组、实验组。正常组为18只大鼠，经静脉注射乌司他丁20万IU/kg。实验组选取18只大鼠，建立大鼠MCAO模型后随即静脉注射乌司他丁20万IU/kg。乌司他丁为广东天普生化医药股份有限公司生产。

1.2 MCAO模型制备 称量大鼠体重，采用腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg对大鼠进行麻醉，待大鼠完全麻醉后将其腹部朝上固定在手术台上。剃毛器剃掉大鼠颈部毛发并消毒，在颈部正中纵向剪开一个长约25 mm的切口，钝性分离肌肉和组织。之后钝性分离出左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。找到颈总动脉并游离出距离颈内动脉、颈外动脉分叉口约10～15 mm的长度，结扎颈总动脉近心端并穿线备用。结扎颈外动脉。用动脉夹夹住颈内动脉远心端，之后快速在距颈总动脉结扎处3 mm处剪一斜切口。将事先做好的线栓自切口轻轻插入，松开血管夹，插入深度约为18～20 mm,稍遇阻力时停止。此时为缺血开始时间，记录时间，同时经静脉注射乌司他丁20万IU/kg。在斜向切口远心端结扎并固定线栓，将线栓多余的部分缝合在切口之间，最后缝合手术切口。在手术2 h后将线栓拔出。在大鼠麻醉状态下，剪开手术切口缝线，钝性分离组织，用镊子夹取线栓轻轻拔出，再次结扎切口远心端并缝合手术切口。手术后将大鼠放置在温暖、安静、避强光的单独鼠笼中饲养。

1.3 组织样本采集 在给药后0.5、3、24 h，两组大鼠分别各随机选取6只，麻醉后取颈静脉血，血液样品置于肝素化抽血管中，离心后取血清备用。取血后立即处死大鼠，端头取脑，脑组织用生理盐水冲净表面血液和内容物，滤纸吸干后保存备用。

1.4 大鼠血清与脑组织中乌司他丁浓度的测定 参考文献[6]的方法，采用酶标仪测定大鼠血清与脑组织中乌司他丁浓度。取用酶标板，使用PBS按适当比例将各组大鼠缺血侧大脑皮层低温物理快速匀浆，离心后取上清。按一定比例稀释血清、脑组织上清液至180 μL后，加入结晶胰蛋白酶溶液20 μL。每孔终体积为200 μL。混匀后37℃保温5 min，每孔加入BAPNA溶液100 μL，摇匀后37℃孵育5 min，设定波长在405 nm处检测吸光度。根据标准曲线测定样品中乌司他丁浓度。采用三乙醇胺、生理盐水作为空白对照。

1.5 大鼠血清与脑组织Bip浓度的测定 取各组大鼠血清、缺血侧大脑皮质上清液样品，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，使用大鼠免疫球蛋白结合蛋白ELISA试剂盒(酶免，China)，按照试剂盒操作说明书操作，测定两组大鼠血清及缺血侧大脑皮质Bip的浓度。

1.6 乌司他丁与Bip的体外结合实验 取乌司他丁标准品(1 000 IU/mL)及Bip标准品(80 pg/mL)各200 μL混合，使得溶液终浓度为：乌司他丁500 IU/mL + Bip 40 pg/mL。将此混合溶液再依次稀释为：乌司他丁250 IU/mL + Bip 20 pg/mL、乌司他丁125 IU/mL+Bip 10 pg/mL、乌司他丁62.5 IU/mL+Bip 5 pg/mL、乌司他丁31.25 IU/mL+Bip 2.5 pg/mL。采用上述酶标仪法、ELISA法分别测定混合液中乌司他丁、Bip浓度，根据测定结果计算两者的结合率。

1.7 计算机分子模拟乌司他丁与Bip的结合 Bip三维结构来自RCSB PDB数据库(PDB ID:5e84)；乌司他丁三维结构来自PubChem(CID:105102)，利用Open Babel GUI对乌司他丁进行格式转换。参照文献[7]的方法，使用分子对接模拟软件(Autodock4.2.6)对Bip进行加氢，计算Gasteiger电荷，对乌司他丁进行操作，完成后进行分子半柔性对接，使用算法为Local Search Parameters，得出对接结果。并利用PyMOL软件构建对接结果。最后，从对接得到的结合构象中取出结合能最小值的构象用于之后的分析。并使用分子模拟软件(DS BIOVIA Discovery Studio 2016 v16.1)，逐一点击Tools/Receptor-Ligand Interacions/View Interaction Ligands，对其进行对接，得出Bip与乌司他丁残基二维相互作用情况。

2 结果

2.1 两组大鼠不同时间点血清、缺血大脑皮质的乌司他丁及Bip浓度变化 在血清样品中，正常组、实验组乌司他丁的浓度均随时间延长而降低，同时也观察到实验组中乌司他丁浓度在0.5 h较正常组升高(P<0.05)。在缺血侧大脑皮质中，正常组、实验组乌司他丁浓度均在3 h较高，24 h后降低(P<0.05)，同时在0.5 h中观察到实验组乌司他丁浓度较正常组降低(P<0.05)。血清中Bip浓度在正常组、实验组各个观察时间点中均没有明显变化(P>0.05)；而在缺血侧大脑皮质中，可观察到实验组缺血侧大脑皮质中Bip浓度在3 h中降低，24 h升高(P<0.05)，同时在3 h中观察到实验组大脑皮质中Bip浓度较正常组低(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠在0.5、3、24 h中血清、缺血大脑皮质中乌司他丁及Bip浓度变化

2.2 乌司他丁与Bip结合率 在乌司他丁与Bip体外结合实验中，已知混合液中乌司他丁浓度分别为：31.25、62.5、125、250、500 IU/mL，实际测定浓度分别为：(30.90±1.51)、(54.24±4.14)、(74.64±3.79)、(124.44±11.35)、(221.06±22.36)IU/mL。已知混合液中Bip浓度分别为：2.5、5、10、20、40 pg/mL，实际测定浓度分别为：(2.42±0.35)、(3.61±0.21)、(6.09±0.62)、(12.47±1.73)、(18.86±1.09)pg/mL。乌司他丁与Bip结合曲线下移，在一定浓度范围内，计算得出两者结合率为44%～62%。见图1。

图1 乌司他丁与Bip的结合曲线

2.3 计算机分子模拟乌司他丁与Bip的结合情况 乌司他丁与Bip中的残基Asp-94、Thr-38、Thr-37、Gly-36、Ser-40、Thr-171、Ser-64、Ser-146、Pro-173、Phe-93、Phe-176、Val-172、Val-92、Ile-145、Thr-184、Val-66、Tyr-65、Pro-142有范德华力作用，与残基Ala-95、Val-149、Lys-96、Ile-99、Leu-35产生共轭作用。见图2。

3 讨论

本研究参照文献[7]的基础上进行改进。我们的前期实验采用酶标仪法测定乌司他丁浓度，根据线性关系实验结果，其相关系数R2均≥0.98，证明线性关系良好，测定精密度和重复性较好。

本研究结果显示，正常组、实验组血清中乌司他丁浓度随时间延长而降低，符合乌司他丁的药代动力学改变。在0.5 h，实验组血清中乌司他丁的浓度较对照组高，但缺血侧大脑皮质乌司他丁浓度则较正常组降低(约降低50%)，表明实验组在脑缺血模型建立后使得血流动力学改变，导致患侧大脑皮层缺血，血流减少，使得脑组织中乌司他丁浓度降低。在缺血再灌注后，大脑皮层血液灌流得以部分恢复，可观察到脑组织中乌司他丁浓度在3 h升高，24 h降低。有研究指出，缺血中风性大鼠梗死灶脑血流在1 h后下降至对照组的45%[8]。也有研究表明，在局灶性脑缺血发生时，在血流降低最严重的脑组织血流量会锐减至正常脑血流量的20%或完全没有血流，从而形成梗死核心区[9]。缺血半影区由于侧支循环的存在依然能保持一定的血液供给[10]。因此，缺血后即给予乌司他丁静脉注射，可通过血流作用于缺血半影区，对缺血性脑组织可能起到一定的保护作用。

注：A：乌司他丁残基与Bip对接模型图；B：乌司他丁残基与Bip分子对接2D示意图图2 PyMOL软件及分子模拟软件构建乌司他丁、Bip分子对接情况

本研究结果显示，在0.5、3、24 h 3个观察时间点，正常组、实验组大鼠血清Bip的浓度无变化，提示Bip作为一种广泛表达在细胞内的分子伴侣，主要作用于细胞内，较少通过细胞膜及血脑屏障释放至血液循环中。本实验观察到，在缺血再灌注3 h，实验组缺血大脑皮质Bip浓度较0.5 h下降，提示存在Bip的消耗或乌司他丁形成结合物，导致ELISA法无法测定结合状态的Bip浓度。随后观察到Bip浓度在24 h升高，一方面可能是由于乌司他丁逐步代谢，与Bip解离，使游离状态的Bip增多，另一方面可能是由于缺血缺氧后应激反应启动基因转录和翻译，使得缺血大脑皮质Bip表达升高。有研究表明，缺血缺氧可引发内质网应激，细胞调亡与Bip等内质网应激分子表达量的改变有关[11-13]。因此，Bip的含量改变与脑缺血再灌注损伤有关。

本研究分子对接软件模拟结果也显示，乌司他丁与Bip中的残基可形成范德华力及共轭作用，但乌司他丁未能与周围残基形成氢键，因此无法形成稳定的复合物。有文献指出，乌司他丁可提高脑缺血再灌注模型大鼠脑皮质中Bip 的表达量[14]，提示两者可能存在某种直接或间接作用。同时在实验中观察到乌司他丁与Bip的结合率约为50%，表明两者确实存在结合作用。

综上所述，在缺血大脑皮质中乌司他丁可与Bip形成不稳定复合物，其可能通过影响Bip的表达而在脑缺血再灌注中发挥着一定作用。