酚类物质添加对‘黑比诺’干红葡萄酒发酵阶段主要香气成分的影响

杨 博，张 波，王学庆，吴娟弟，韩丽婷，李宁宁，韩舜愈

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃省葡萄与葡萄酒产业技术研发中心，兰州 730070)

香气是评价葡萄酒品质的重要指标之一，其种类和含量构成不同葡萄酒的风格特征[1-2]。研究表明，葡萄酒中己有1 300多种香气化合物被报道，并受葡萄果实自身、葡萄酒酿造过程和陈酿条件的影响[1-3]。同时，部分研究也指出，葡萄酒的香气除与上述因素直接相关外，酒中的一些基质成分也会对香气的表达产生作用，在一定程度上影响葡萄酒的香气质量[4-5]。因此，研究酒中基质成分对其香气物质的影响，对控制和提高葡萄酒的香气品质具有重要意义。

多酚作为葡萄酒中一类重要的基质成分，除在葡萄酒的口感和色泽上有较大贡献外，对改变体系香气组分浓度和质量也有影响[6-7]。例如，在含多酚的模拟溶液中，4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的挥发程度随多酚含量的增加而显著降低，尤其当达到最高浓度时，其含量较对照分别减少了24.2%和26.4%[4]。同时，多酚与香气物质的作用具有一定的选择性，例如相比于较难结合的柠檬烯分子，儿茶素即便在较低浓度下也会对乙酸异戊酯、己酸乙酯和苯甲醛产生强烈的亲和力[8]。多酚还会影响香气化合物的气味感知和风味质量。Lund等[9]发现，增加溶液中儿茶素和槲皮素的浓度会明显降低3-巯基己醇的嗅感强度。而含多酚溶液在对β-苯乙醇等受试香气物质风味特征减弱的同时，其嗅感强度还存在随多酚浓度变化的特点[10]。

咖啡酸是葡萄酒中主要的酚类化合物，而迷迭香酸是咖啡酸的结构类似物(由咖啡酸和丹参素酯化形成)，两者在自然界中均属常见的多酚物质[11]。有研究分别测试了咖啡酸和迷迭香酸等酚类物质的辅色特性，发现其对葡萄酒的色泽具有较好的保护作用[12-13]。不过笔者在前期研究中除发现上述酚酸产生的辅色效应外，还观察到其对葡萄酒香气也产生作用，并且结构相似的多酚存在不同的作用效果[11]。

尽管在葡萄酒的生产中添加酚类物质已成为常见的操作，但在以往研究中较多的报道主要集中在其对葡萄酒色泽品质方面，而对其他品质的影响却少有报道，尤其是多酚对葡萄酒呈香方面，大量的研究结果或来自于模拟试验，或是对样品的静态测定，对于在发酵过程添加酚类物质引起香气成分动态变化的报道目前还相对有限。因此，本试验拟以甘肃河西走廊产区‘黑比诺’葡萄为试材，通过在酒精发酵前添加具有良好辅色性能的咖啡酸与迷迭香酸等酚类物质，探究其对发酵阶段葡萄酒中主要香气成分的影响，以期为进一步开展酚类物质在葡萄酒生产中的应用提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：黑比诺葡萄(Pinot Noir)，甘肃景泰酿酒葡萄种植基地，可溶性固形物21.7°Brix、可滴定酸6.50 g/L(酒石酸计)、pH为3.61；酿酒酵母(D254)、乳酸菌(Oenococcusoeni)，法国Laffort公司；果胶酶，法国Lallemand公司。

试剂：咖啡酸、迷迭香酸(食品级)，陕西润生生物科技有限公司；2-辛醇(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；乙醛、偏重亚硫酸钾、没食子酸、碳酸钠、氢氧化钠、碘、碘化钾、淀粉(分析纯)，上海源叶生物科技有限公司；乙酸钠、乙酸、盐酸、氯化钾、氯化钠(分析纯)，天津市光复科技发展有限公司。斐林试剂、次甲基蓝指示剂等按照GB/T 603-2002进行配制。

1.2 仪器与设备

pH计(PHS-3C)，上海雷磁仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TD5A-WS台式低速离心机，东莞康润试验科技有限公司；固相微萃取装置、 50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅萃取头，美国Surpelco公司；TRACE1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪，法国Salleron公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酿造工艺 葡萄原料→分选→除梗破碎后均匀分装在9个20 L的不锈钢桶中(添加60 mg/L SO2，20 mg/L果胶酶)→进行未加酚酸、分别添加150 mg/L咖啡酸和迷迭香酸3种处理(试验前参考已有文献报道[14])→4 ℃恒温冷浸渍48 h→室温下回温至16 ℃→酒精发酵(添加200 mg/L酿酒酵母)→皮渣分离→苹-乳发酵(添加20 mg/L商业乳酸菌)→发酵结束。

根据发酵工艺，按比重分别在葡萄破碎(Init)、酒精发酵前(PFM)、酒精发酵中期(m-FA)、酒精发酵结束(e-FA)、苹-乳发酵中期(m-MLF)、苹-乳发酵结束(e-MLF)6个点取样，每个取样点取样量为200 mL，分装于棕色瓶中，迅速置于 -20 ℃冰箱保存，待测。每个处理重复3次。

1.3.2 葡萄酒基本理化指标测定 酒精度、残糖(葡萄糖计)、总酸(酒石酸计)、挥发酸(乙酸计)、pH、游离和总SO2参照GB/T 15038-2006[15]测定。

1.3.3 葡萄酒香气化合物测定 香气物质萃取和GC-MS检测条件参照鲁榕榕等[16]的方法。

定性分析：采用质谱信息、NIST08标准谱库对比，以及参考相关文献相结合的方法进行定性分析。

定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标为2-辛醇。计算公式如下：

各香气成分含量=(各组分的峰面积×内标物质量浓度)/内标物峰面积

1.3.4 香气轮廓分析 参考Capone等[17]的方法，并根据葡萄酒香气轮中的香气类型[1]将试验香气物质分为果香、花香、植物味、化学味、脂肪味、香料味等。样品中检测到的主要挥发性物质按其气味特征进行分组，气味特征类似的物质归为同类，并计算该类的气味活性值(Odor Activity Value，OAV)总和，即可对香气轮廓进行模拟。

OAV值=香气化合物含量/阈值

1.3.5 数据处理与分析 利用Microsoft Office Excel 2010和Origin 2018对试验所得数据进行处理及作图，使用IBM SPSS Statistics 20进行显著性分析(Duncan’s法，P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 酒样理化指标

由表1可知，3组处理酒样总糖<4.00 g/L，酒精度>11.00%，表明供试样品符合国标GB/T 15037-2006干型葡萄酒的要求。样品的挥发 酸<1.20 g/L，说明生产过程卫生条件控制良好，且酒样的总酸、pH、SO2等指标也均满足国标规定。

表1 酒样的基本理化指标Table 1 Basic physical and chemical indexes of wine samples

2.2 添加处理对黑比诺干红葡萄酒香气品质的影响

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用方法对供试样品的挥发性成分进行测定，共检出酯类、醇类、酸类、萜烯类和其他类等5类组分，共计125种香气化合物。基于已报道的文献资料[18-21]，并综合考虑各挥发性物质含量、阈值水平和OAV值等因素，最终筛选出共同含有且含量较高的26种香气物质进行具体分析。

2.2.1 发酵过程中酒样主要香气物质分析 共检测到酯类物质54种，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯等8种为主要化合物。由图1可知，随着发酵时间的延长，酒样中大多数的酯类物质在苹-乳发酵阶段(MLF)含量积累达到峰值。例如己酸乙酯，咖啡酸处理酒样在PFM时含量最高，随后其含量逐渐增加，在m-MLF达到峰值，较PFM时提高575.52～2 685.26 μg/L。e-MLF后，咖啡酸处理酒样中己酸乙酯含量达到 1 498.35 μg/L，分别是对照和迷迭香酸处理的 1.11倍和4.57倍。类似的现象在乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯的变化

中也有体现。同时，试验结果显示，迷迭香酸的添加对发酵阶段酯类含量的积累有明显抑制效果(P<0.05)。随着发酵过程的进行，迷迭香酸处理的酒样中以上各酯类浓度均明显低于咖啡酸和对照样品。例如，辛酸乙酯从PFM到酒精发酵结束(e-FA)，尽管各酒样均具有升高的变化趋势，但其含量却表现为对照>咖啡酸>迷迭香酸的序列效果。而在MLF阶段，辛酸乙酯浓度逐渐降低，但依旧表现出迷迭香酸处理下含量较低的现象(P<0.05)。对于丁酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯而言，虽有个别时期添加酚酸处理样品有较高的含量，但总体也表现出酚类处理后浓度下降的变化，并且迷迭香酸处理效果高于咖啡酸处理组和对照组。甚至对于乙酸异戊酯，笔者还观察到迷迭香酸处理后其含量积累峰值推迟的变化。研究表明，乙酸酯类物质主要是由微生物的代谢产生。因此笔者推测试验观察到的乙酸酯类浓度降低的情况可能与添加酚类物质减缓微生物代谢效率有关[20]。此外，从图1还可看到，伴随着MLF的进行，乳酸异戊酯的含量也发生了类似的变化。这可能是MLF过程中产生的乳酸与酒中的高级醇酯化的结果。不过相比于对照，咖啡酸处理酒样中乳酸异戊酯含量相对较高(P<0.05)，而迷迭香酸处理酒样中的乳酸异戊酯含量却降低44.21%(e-MLF)。

从样品中检测到6种主要醇类化合物(图2)，其中正己醇、2,3-丁二醇和苯乙醇等在MLF阶段含量最高，随后其浓度均逐渐降低，而丙醇、异戊醇和苯甲醇等3种醇类物质伴随发酵的进行含量逐渐增加，并在e-AF达到峰值。同时，丙醇在PFM到e-FA期间的含量表现出咖啡酸>迷迭香酸>对照的现象。而与丙醇表现不同的是，正己醇在迷迭香酸处理样品中的含量显著增加，并在m-MLF时含量达到最高，较对照和咖啡酸分别高出17.76%和60.84%，这将对增加酒体的甜香感有积极意义。类似的现象在2,3-丁二醇的变化中也有发现。此外，咖啡酸处理酒样中苯乙醇在PFM到e-MLF整个发酵过程中含量较高，而迷迭香酸处理酒样浓度却显著低于对照 (P<0.05)。研究认为，苯乙醇可能来自发酵过程中苯丙酮酸的代谢，并通过莽草酸途径形成分支酸，之后在变位酶的催化下，经脱水、脱羧作用形成[22]。而咖啡酸为莽草酸代谢过程中的一种中间产物，因此推测外源添加的咖啡酸可能作为苯乙醇合成的底物参与了其形成的积累过程。

从3种供试样品中检测到13种酸类物质，其中异丁酸、正己酸、正辛酸和正癸酸4种是主要的酸类化合物。由图3可知，大多数酸类化合物在整个发酵过程的变化趋势与酯类物质相似。异丁酸在m-FA到m-MLF过程中其含量逐渐增加，表现为对照>咖啡酸>迷迭香酸的效果，并在m-MLF时含量积累达到最高，随后在MLF阶段含量逐渐降低，且咖啡酸处理明显表现出浓度增加的现象(e-MLF阶段，咖啡酸处理较对照和迷迭香酸分别增加了26.07%和25.10%)。而正癸酸在PFM至e-MLF阶段，其咖啡酸处理酒样的含量显著高于对照和迷迭香酸处理酒样 (P<0.05)，例如在e-MLF阶段，其浓度分别是对照和迷迭香酸处理酒样的2.67倍和5.13倍。试验检测到的正辛酸也具有类似的现象。同时，试验还发现，添加咖啡酸和迷迭香酸处理的葡萄酒中正己酸含量表现出明显的差异(P<0.05)，如在m-FA时，咖啡酸处理酒样的含量最高为25.57 μg/L，分别高出对照和迷迭香酸处理酒样的 50.32%和72.30%。研究表明，葡萄酒中的酸类化合物浓度较低时可增加果酒香气的复杂性，含量过高则会产生令人不快的感觉[23-24]。就整个发酵过程而言，迷迭香酸处理酒样中正己酸含量的峰值出现推迟的现象，并在MLF过程中降低至消失，这将会减弱对样品带来的负面影响，推测这可能与发酵过程中香气物质的挥发损失、代谢分解或合成其他物质有关。此外，本试验中有少量挥发性脂肪酸类物质生成，同对照相比，随发酵过程的进行，其在迷迭香酸处理酒样中浓度相对较低，且浓度远低于阈值，这将有助于改善葡萄酒的风味，对葡萄酒具有积极的贡献。

本试验检测出香茅醇、香叶醇和α-松油醇等3种主要的萜烯类化合物。分析图4各香气物质的变化可知，随着发酵时间的延长，供试酒样中香茅醇、香叶醇的含量逐渐增加，并在酒精发酵阶段达到峰值，例如两个处理样品中的香茅醇在整个发酵阶段的浓度均低于对照(m-MLF时期除外)，特别在e-FA时，咖啡酸和迷迭香酸处理较对照酒样分别降低58.75%和91.68%，表现出迷迭香酸对其具有显著的抑制效果(P<0.05)。类似的变化在香叶醇中也有体现。咖啡酸处理酒样中α-松油醇在m-MLF至e-MLF时含量显著高于其余两组样品(P<0.05)，并在m-MLF阶段含量积累达到峰值。另外，对照、咖啡酸和迷迭香酸处理酒样中的α-松油醇从破碎时(Init)的 0.16 μg/L分别增加到1.62 μg/L、2.93 μg/L和 2.16 μg/L，特别是在e-MLF时期，咖啡酸处理酒样中α-松油醇是对照的2.97倍，而迷迭香酸处理酒样较对照组增加17.95%。同时，试验还检测到β-大马士酮等C13-降异戊二烯类化合物。由图4可知，β-大马士酮在m-MLF至e-MLF发酵过程中含量表现为咖啡酸>对照>迷迭香酸的变化趋势，在m-MLF阶段，咖啡酸处理酒样达到峰值，较对照和迷迭香酸处理分别增加 16.31%和 50.97%。而迷迭香酸处理和对照组在e-FA时其含量最高，之后各酒样的含量均有所降低。在e-MLF时咖啡酸处理酒样的β-大马士酮浓度高出其余两个处理酒样的4.52%～ 20.82%，这将有可能增强酒体的花果香。

此外，本试验还检测出12种其他类物质，其中壬醛、苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚等4种是主要的香气化合物，这些物质对于酒体的平衡有一定的贡献。由图5可知，苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚在e-FA和m-MLF时期含量达到最高，随后各物质浓度逐渐下降。本试验还发现咖啡酸处理酒样中2,4-二叔丁基苯酚含量峰值推迟的现象，且相应含量在m-MLF至e-MLF阶段表现为咖啡酸>迷迭香酸>对照的效果。迷迭香酸处理酒样中的2,6-二叔丁基对甲酚在m-MLF时的浓度出现极值，分别高出对照和咖啡酸处理样品的10.27%和20.39%，而壬醛在整个发酵过程中却表现出与上述物质不同的变化规律，在供试酒样中其含量均呈上升趋势。同Init时期相比，对照、咖啡酸和迷迭香酸处理酒样中的壬醛在e-MLF时分别提高10.81 μg/L、10.70 μg/L和9.83 μg/L，且添加酚类物质的酒样表现出明显的抑制效果 (P<0.05)。

2.2.2 酒样香气轮廓模拟、主成分及聚类热图分析 供试葡萄酒中的香气成分主要包括酯类、醇类、酸类、萜烯类和其他类等125种香气化合物，这些香气化合物可通过累积、协同、抑制和掩蔽等作用使葡萄酒的香气复杂多变[17]。因此，为了直观体现葡萄酒的香气特征，以e-MLF的酒样为基准，参考已报道的文献资料[18-21]，并综合考虑各挥发性物质的含量及阈值水平等因素，笔者对供试酒样中检出的125种挥发性化合物进行筛选， 共挑选出50种特征香气物质(表2)进行后续 分析。

表2 酒样香气物质的OAV值Table 2 OAV values of aroma components in wine samples

由图6可以看出，3种供试样品的香气轮廓较为相似，主要表现为花香、果香特征。相比于迷迭香酸处理和对照组酒样，添加咖啡酸的酒样具有较高的花香(72.57)和果香值(188.42)，分别高出其余两组酒样4.13%～32.89%和8.33%～138.20%。综合分析，添加不同酚类物质的酒样对其香气特征的关系表明，咖啡酸处理酒样相比于迷迭香酸处理酒样表现出较为浓郁的花果香味。

由主成分分析可知(图7)，供试样品之间有明显的成分特征区别，特别是两种添加酚类物质处理的酒样，其中咖啡酸在PC2正半轴上得分较高，主要表现为酯类及萜烯类等物质，而迷迭香酸在PC1负半轴得分较高，此区域主要代表高级醇的香气信息。进一步的聚类热图分析发现(图8)，相比于迷迭香酸和对照组酒样，添加咖啡酸的样品与癸酸乙酯等具有水果香气特征的物质有较高的相关性。而迷迭香酸处理酒样与己酸乙酯、苯甲醛和苯乙醇等有较高的相关性，这些特征香气物质可提升葡萄酒的香气复杂性。

3 讨 论

研究发现，酚类物质会改变香气化合物的挥发性及分配系数，并伴随有感官知觉的变化。这些反应可能与多酚成分和芳香化合物的相互作用或结合有关，从而影响其释放与感知[25-26]。对比本试验结果发现，迷迭香酸和咖啡酸在影响主要香气物质积累方面表现不同，其中迷迭香酸的添加对发酵阶段酯类物质的含量积累有明显的抑制效果；而正己醇和2,3-丁二醇等醇类物质会随咖啡酸的加入表现出显著的抑制现象。结合上文的结果，笔者推测造成本试验两种酚类物质香气影响效果不同的原因可能与其结构相关。相比咖啡酸分子的单个苯环平面，迷迭香酸分子结构中含有2个酚环基团，使得后者可以提供更大的作用表面。同时，其环平面上的多个羟基位点，也为其与香气物质结合提供了帮助[27]。不过具体有关结构差异是如何影响香气物质结合的问题还需做进一步的分析。此外，对于整个发酵过程而言，酚类物质对香气化合物的影响，除可能与结合性能的差异有关外，是否也存在类似酚类物质影响发酵阶段花色苷浸渍效率的现象，形成不同多酚物质对相同香气化合物相异的浸出效果，而有关这一问题也需做进一步的研究。

4 结 论

本试验研究酚类物质添加对‘黑比诺’干红葡萄酒发酵阶段主要香气成分的影响，结果表明：添加咖啡酸和迷迭香酸的葡萄酒其基本理化指标均符合国标要求。分析发酵阶段主要香气物质变化发现，随发酵时间的延长，类别相同的物质在整个发酵过程中具有相似的变化趋势，且各类香气物质随酒精发酵的进行含量逐渐积累，但在苹-乳发酵阶段其浓度呈一定的下降趋势。其中添加咖啡酸可明显增加葡萄酒中乳酸异戊酯、苯乙醇和α-松油醇等香气物质的含量，而添加迷迭香酸显著增加2,3-丁二醇等物质的含量。

香气轮廓模拟表明，咖啡酸处理酒样呈现浓郁的花香和果香，而迷迭香酸处理酒样的整体香气特征较差。同时，主成分和聚类热图分析结果显示，咖啡酸处理酒样与乙酸乙酯、辛酸乙酯、香叶醇和β-大马士酮等主要酯类、萜烯类及C13-降异戊二烯类香气物质的含量具有较高的相关性。