5种苹果野生资源果实香气物质的分析

杜 薇，陈丽娟，李 瑞，田晓宁，刘翠华，任小林

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

苹果营养价值高、生态适应性较强、耐贮性强、供应周期长，是世界四大水果之一，深受广大消费者的喜爱[1]。苹果是中国产量最高的水果，占全国水果(含瓜果类)总产量的15.81%。同时，苹果果树也是目前种植面积最大、经济地位最重要的果树。苹果树在很多方面有着重大作用，包括扩大出口创汇、促进农民脱贫致富、发展中国农村经济、改善生态环境等。苹果的香气品质是影响果品鲜食、加工的重要因素，也是研究苹果品质和果品深加工重要理论依据之一[2-3]。对于苹果香气物质的研究，目前主要是在栽培品种上，在野生品种上的研究比较少[4]。然而苹果具有丰富的野生资源，包括5组40余个种，且与苹果栽培品种进化中关系最近的是真正苹果组中苹果系的资源[5-8]。本试验以苹果系的楸子 (Malusprunifolia)、海棠花 (Malusspectabilis)、西府海棠 (Malusmicromalus)、花红(Malusasiatica)和新疆野苹果(Malussieversii)为研究对象，通过比较分析苹果系5个不同种果实香气物质的组成、含量以及它们之间香气物质的差异，同时结合不同种果实特征进行香气分析，为苹果野生资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材 料 楸子、新疆野苹果、西府海棠、海棠花、花红的果实采于西北农林科技大学园艺场。在苹果果实成熟期采收果实 1～2 kg(要求健康、无病虫害、无机械损伤)，带回实验室后，挑选外观大小和成熟度一致的着色均匀的果实。

1.1.2 试 剂 内标3-壬酮、计算保留指数(retention index，RI)的C7-C30饱和系列烷烃以及香气物质的定性和定量的标准样品：己醛、1-丁醇、1-戊烯-3-醇、异戊酸香叶酯、反式-2-己烯醛、辛醛、己醇、壬醛、苯甲醛、己酸己酯、法呢烯、法尼醇均购自Sigma-Aldrich公司(上海，中国)；反式-2-癸烯醛、乙酸丁酯、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醇、辛酸、麝香草酚购自Alfa Aesar公司(天津，中国)；提取香气物质的溶剂甲基叔丁基醚(MTBE)购自美国Tedia公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS(ISQ气相色谱-质谱联用仪)购自美国Thermo Fisher公司、D-37520型离心机购自美国Thermo Fisher公司、SB25-12DTD超声波清洗仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司、MD-200干式氮吹仪购自杭州奥盛仪器有限 公司。

1.3 方 法

1.3.1 果实取样 果实跃变期时，取楸子、海棠花、西府海棠、花红、新疆野苹果果实各20个，用打孔器进行打孔取样，并将获得的样品在液氮中冷冻，每个样品设置 3 个生物学重复，随后将其存入-80 ℃ 环境中，用于香气物质的提取。

1.3.2 香气物质的提取 方法参考石金瑞等[9]液—液溶剂萃取法，萃取溶剂为 MTBE。

将样品置于研钵中，加入液氮研磨成均匀粉末状；称取2 g研磨后样品置于10 mL离心管内，加入 3 mL 的蒸馏水后将其震荡混匀；分别取 3 mL MTBE溶液与10 μL内标[V(3-壬酮)∶V(甲醇)= 5∶30 000]至样品所在10 mL离心管内，25 ℃下超声波清洗仪中萃取 30 min ；萃取后离心15 min(4 ℃，11 000 r/min)；取900 μL的上清液在氮吹仪中缓慢浓缩至300 μL；样品存入内置200 μL玻璃内衬管的2 mL 进样瓶中，待测。

1.3.3 色谱条件 色谱柱为VF-WAXms 柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升温程序初温 40 ℃ 并保持 3 min，然后以5 ℃/min 升至 150 ℃，以 8 ℃/min 升至 220 ℃，并保持10 min；进样口温度为230 ℃；进样量为1 μL；载气为高纯度He，载气流量流为1 mL/min，进样时不分流。

1.3.4 质谱条件 电子轰击离子源，电子能量为 70 eV，激活电压为 1.5 eV，离子源温度为 240 ℃，传输线温度为 240 ℃，质量扫描范围为33～380 m/z，扫描时间从 4 min 开始。

1.3.5 定性定量分析 香气物质定性：对照NIST/EPA/NIH质谱数据库(NIST2014)进行解谱分析，并通过标准物质结合香气物质的 RI 进行定性。

香气物质定量：用MTBE 溶液稀释标准试剂[V(标样)∶V(MTBE)=1∶150 000]，而后加入内标[V(3-壬酮∶V(MTBE)=1∶900 000)]。取 1 μL 标准试剂混合液用于 GC-MS 分析，条件同上[10-11]。使用相应标准试剂的校正因子(correct factor，CF)对各香气组分进行定量计算。其公式为：CF=[(C1/A1)/(C2/A2)]。C1：标准试剂浓度，C2：内标浓度，A1：选择离子模式下标准试剂的峰面积，A2：内标峰面积，3-壬酮的QI=113[11-12]。各香气组分计算公式为：C3=CF· A3·C4/A4。C3：被测香气组分浓度；CF ：被测组分校正因子；A3：被测组分在选择离子下的峰面积；C4：样品内标浓度；A4：样品内标峰面积。

1.4 数据处理

GC-MS 原始数据文件经 Xcalibur 和 AMDIS 解析后，采用Microsoft Excel 2019对数据进一步整理和分析。采用SPSS 22对不同香气总量进行主成分分析和载荷分析。

2 结果与分析

2.1 5种野生资源香气物质比较

2.1.1 5种野生资源香气成分的差异 如表1 所示，在花红、新疆野苹果、西府海棠、海棠花和楸子果实中共检测到27 种香气物质，包括醇类 6 种、醛类 7 种、酯类 4 种、有机酸 4 种、萜烯类 2 种以及苯衍生物 4 种，其中共有的香气物质为反式-2-己烯醛、辛酸、α-法呢烯、苯酚以及对甲苯酚。海棠花果实的香气物质种类最多，共检测到 20 种香气物质，其中醇类 5 种、醛类 5 种、酯类 2 种、有机酸 3 种、萜烯类2 种、苯衍生物 3 种。其次为新疆野苹果，果实中共检测到 15 种香气物质，其中醇类 4 种、醛类 3 种、酯类 1 种、有机酸 2 种、萜烯类2 种、苯衍生物 3 种。花红果实与西府海棠果实中均鉴定出 14 种香气物质，但种类有所不同：花红果实香气物质组成为醇类4 种、醛类4 种、有机酸2 种、萜烯类1 种、苯衍生物3 种；而西府海棠果实香气物质组成为醇类 2 种、醛类 5 种、酯类 1 种、有机酸 2 种、萜烯类 1种、苯衍生物 3 种。楸子果实中鉴定出的香气物质种类最少，只有 11 种，其中包括醇类 2 种、醛类 2 种、酯类 2 种、有机酸 2 种、萜烯类 1 种、苯衍生物 2 种。

2.1.2 5种野生资源香气组成的特点 5种苹果果实的香气成分含量上存在明显差异。其中海棠花果实中香气物质总含量最高，为 48 167.11 μg/kg，是花红果实香气物质总含量的 6 倍，楸子果实香气物质总含量的 5 倍。其次是新疆野苹果与西府海棠，它们果实中香气物质总含量分别为 16 489.93 μg/kg、13 362.83 μg/kg。楸子果实香气物质总含量较低，为 9 598.65 μg/kg，而花红果实香气物质总含量最低，只有 7 902.94 μg/kg (表 1)。

表1 5种野生资源苹果果实香气成分Table 1 Aroma constitutions of five wild apple species

通过比较这 5 种果实香气物质组成和含量发现，它们所含主要的香气物质各不相同。花红果实中含量最高的一类香气物质是醛类物质，占总含量的56.03%，其中反式-2-己烯醛和己醛分别占总含量的 35.88%和15.84%；其次为萜烯类和苯衍生物类物质，分别占总含量的 12.92%和18.74%。醛类物质同时也是西府海棠和楸子中香气物质含量最高的种类，分别占西府海棠和楸子总香气物质的 47.62%和44.06%。而萜烯类物质是新疆野苹果与海棠花中最主要的一类香气物质，分别占新疆野苹果与海棠花总香气物质含量的 64.34% 和 77.16%，其中 α-法呢烯在新疆野苹果和海棠花总香气物质含量中分别高达 63.72% 和77.08%，为含量最高的香气物质 (图1)。

2.2 5种野生资源特征香气差异

香气值(odor activity value，OAV)为某种化合物的浓度与该化合物香气阈值的比值，香气值(OAV)大于1的成分为特征香气成分[13]。其中香气阈值是指嗅觉器官感觉到气味时，嗅感物质的最低浓度。香气的相对贡献采用香气值归一化法确定，香气值越大，贡献率越大[14]。5 个野生苹果种果实香气成分中 OAV 值大于 1 的香气物质共有 8 种，分别是法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、辛醛、壬醛、反式-2-癸烯醛、乙酸丁酯和己酸己酯(表2)。

表2 5种苹果果实特征香气物质的香气值Table 2 Characteristic aroma compounds OAV of five apple species

2.2.1 海棠花特征香气物质 海棠花的特征香气物质有6种，分别是法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、壬醛、反式-2-癸烯醛、己酸己酯，醛类物质是主要的特征香气物质，香气贡献率高达85.37%，其中反式-2-己烯醛的香气值为331.64，香气贡献率为53.92%。而法呢醇是主要的醇类特征香气物质，香气贡献率为13.64%，己酸己酯是主要的酯类特征香气物质，香气贡献率为5.49%。

2.2.2 西府海棠和花红苹果特征香气物质 西府海棠的特征香气物质有5种，分别是法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛、辛醛、己酸己酯。其中醛类物质的香气值最高为457.75，贡献率高达96.60%。花红苹果的特征香气物质有两种，分别是己醛与反式-2-己烯醛，香气值分别为119.92、166.78，贡献率分别为41.53%、58.10%。

2.2.3 新疆野苹果和楸子特征香气物质 新疆野苹果和楸子的特征香气物质都有4种，但种类以及各香气物质的香气值，贡献率各不相同。新疆野苹果的特征香气物质有法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛和己酸己酯，其中反式-2-己烯醛的贡献率最高为49.11%，其次为壬醛、法呢醇，贡献率分别是27.99%、20.77%。楸子的特征香气物质有法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛和乙酸丁酯，其中己醛与反式-2-己烯醛这两个醛类物质的香气值比较高，分别为71.69、204.51，贡献率分别为 23.15%、66.04%。

2.3 主成分分析

对香气值(OAV)大于1的香气物质(表2)进行主成分分析(PCA)，共计8种香气物质。以各香气物质的香气值为测定指标，当累计贡献率达到85%以上时，确定主成分的个数[15]。

由表3可知前3个主成分表达了原有数据90.09%的信息量，表明主成分分析能够较好地将原始信息约化在主分量中[15]，所以本研究选择前3个为主成分(PCA)。

表3 主要香气化合物相关矩阵特征值Table 3 Related eigenvalues of matrix in main aroma components

表4为各主成分的因子载荷量，分析可知第一主成分(PC1)代表己酸己酯(0.995)、壬醛 (0.962)、法呢醇(0.951)；第二主成分(PC2)代表反式-2-癸烯醛(0.836)、己醛(0.793)、反式-2-己烯醛(0.748)；第三主成分(PC3)代表为辛醛 (0.852)、乙酸丁酯(0.596)。将3个主成分所代表香气化合物归成3类，即以PC1代表的化合物为第一类；以PC2代表的化合物为第二类；以PC3代表的化合物为第三类。

表4 主成分的因子载荷量Table 4 Factor load of principal components

图2是5种苹果对第一主成分和第二主成分的散点图，根据第一和第二主成分散点分析结果，可将5种果实的香型分为3类，海棠花为一类；花红、西府海棠、楸子为一类；新疆野苹果为一类。

结合图2与图3可知，海棠花组含有的3类香气物质总香气值最高为614.46，且各类香气物质的含量与其他4个种相比，也是最高的。其中第一类香气物质的总香气值(173.62)是西府海棠(47.16)和楸子(31.53)的约3～4倍；第二类香气物质的总香气值(440.84)是花红(286.01)的1.5倍。其次海棠花各类香气物质的总香气值中第二类香气物质的最高，其次为第一类香气物质。

花红、西府海棠、楸子组中第二类香气物质(反式-2-癸烯醛、反式-2-己烯醛、己醛)总香气值最高，而第一类香气物质(己酸己酯、壬醛、法呢醇)总香气值很低，甚至是在花红果实中未检测到第一类香气物质。新疆野苹果组最主要的特点是果实第一类香气物质的总香气值与第二类香气物质的总香气值相近，分别为壬醛和法呢醇、反式-2-己烯醛。

3 讨 论

苹果中已经鉴定出 300 多种香气物质，包括酯类、醛类、醇类、酮类、萜烯类等，其中酯类、醇类、醛类是主要的香气物质[16]。根据特征香气物质的组成不同，可将苹果分为两类：一类是以酯类物质为主的“酯香型”，如美国的元帅系苹果；另一类是以醇类物质为主的“醇香型”。而根据人们对不同化学结构的香气物质的感觉不同，又可将水果香气划分为“果香型”“清香型”“辛香型”和“醛香型”等[15]。其中“果香型”化合物是指那些有成熟水果香气且伴有香甜气味的物质，如乙酸丁酯、乙酸乙酯等各种酯类物质；“清香型”化合物是指具有绿色植物清香气，能使人联想到刚采摘下来的草或树叶的香气的物质，大多为C6及C9的醛类、醇类物质[17-21]。

本研究中的 5 个野生苹果种果实共有的香气物质为反式-2-己烯醛、辛酸、α-法呢烯、苯酚以及对甲苯酚。苯甲醛为花红苹果的特有的香气物质；2-苯基乙醇为新疆野苹果特有的物质；壬醛为西府海棠特有的香气物质；1-戊烯-3-醇、反式-2-癸烯醛、正戊酸为海棠花特有的香气物质；乙酸丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、庚酸为楸子特有的香气物质。5 个苹果种果实香气成分在物质组成和含量上均有很明显差异。其中海棠花香气物质总含量最高，香气物质种类最多，其次为新疆野苹果与西府海棠，总含量最低的为花红。醛类物质是花红、西府海棠、楸子的主要香气物质，含量占总含量的百分数分别是56.03%、47.62%、44.06%。而萜烯类物质是新疆野苹果与海棠花的主要香气物质，分别占总含量的 64.34%、81.91%。通过对 5 种苹果特征香气物质的分析发现，这 5 个野生苹果果实的特征香气物质主要以反式-2-己烯醛等醛类物质为主，酯类物质含量低。且通过主成分分析发现 5 种苹果果实香气物质以第二类香气物质为主，而第二类香气物质为反式-2-癸烯醛、反式-2-己烯醛、己醛，这与‘澳洲青苹’的特征香气成分相似，这 5 种野生苹果果实香型也为 “清香型”，其主要特征香气物质为反式-2-己烯醛等醛类物质，果实呈现清新淡雅的香气特点[22]。

果实的香气形成受多种因素的影响，果实成熟度[23]、外界环境因子、栽培条件、采后贮藏条件、品种[24]、砧木[25]等因素都会对水果香气的形成造成一定的影响。因此本试验数据只能说明在一定条件下的这5个野生苹果种果实的特征香气成分。

4 结 论

花红果实中共检测出 14 种香气物质，其中主要是醛类，其次为萜烯类和苯衍生物类，特征香气物质是己醛与反式-2-己烯醛。 新疆野苹果果实共检测出 15 种香气物质，其中主要是萜烯类，其次为醛类和醇类，特征香气物质是法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛、己酸己酯。 西府海棠果实共检测出 14 种香气物质，其中主要是醛类与萜烯类，其次为苯衍生物，特征香气物质是法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛、辛醛、己酸己酯。海棠花果实共检测出 21 种香气物质，其中主要是萜烯类，其次为醛类，特征香气物质是法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、壬醛、反式-2-癸烯醛、己酸己酯。楸子果实共检测出 11 种香气物质，其中主要是醛类，其次为萜烯类，特征香气物质为法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、乙酸丁酯。5 种苹果野生资源果实香气物质组成和含量有显著差异，其中海棠花香气物质总含量最高，其次为疆野苹果与西府海棠，总含量最低的为花红。5 种苹果野生资源果实特征香气物质以反式-2-己烯醛等醛类物质为主，属于 “清香型”果实。