利用流式细胞术鉴定杏及其部分近缘植物的倍性

杨 丽，孙浩元，张俊环，闫爱玲，姜凤超，张美玲，王玉柱

(1.北京市林业果树科学研究院,北京 100093；2.北京市落叶果树工程技术研究中心，北京 100093；3.国家林业和草原局杏工程技术研究中心，北京 100093)

杏是原产中国的古老果树树种，目前广泛分布于世界各地，种质资源十分丰富，据统计，世界上的杏约有10～12个种[1]，被用作鲜食、仁用、观赏、砧木等多种用途。杏和李同为蔷薇科(Rosaceae)李属(PrunusL.)植物，亲缘关系近，在长期生长、进化和栽培利用过程中，二者之间形成了许多天然或人工杂交种质。如紫杏(P.dasycarpaEhrh.)是以樱桃李(P.cerasiferaEhrh.)为母本与普通杏(P.armeniacaL.)种间杂交天然形成[2]，杏李是李与普通杏多代杂交选育而来[3-5]。牟蕴慧等[6]利用李杏远缘杂交育成杏新品种‘龙园甜杏’。现有研究表明杏为二倍体[7-9]，而不同种的李则有倍性的差异，中国李(P.salicinaLindl.)、美洲李(P.americanaL.)、樱桃李、乌苏里李(P.ussuriensisKov.&kost)、杏李 (P.simoniiCarr.)(不同于远缘杂交杏李)为二倍体、黑刺李(P.spinosaL.)为四倍体、欧洲李(P.domesticaL.)为六倍体[10]。果树多倍体具有生长旺盛、果实大且少籽或无籽、产量高、适应性和抗性强等特点，且能够利用无性繁殖的方式固定其优良性状，使之保持稳定而不分离，在生产上长期利用，因此果树多倍体的发掘、培育与利用是果树育种的重要内容[11]。果树多倍体可以通过自然变异、人工诱导或有性杂交产生。蒲富慎等[7]和林盛华等[8]用染色体计数法对150个李品种和422个杏品种进行倍性鉴定，发现来自高寒地区的2份中国李三倍体种质资源和1份三倍体杏种质资源‘泰安杏梅’；苹果、梨、枣、山楂等果树树种中均有通过自然变异选育出的多倍体品种[11]。

多倍体砧木能够诱导嫁接植株矮化，提高植株对干旱、低温、缺铁、盐害及重金属等非生物胁迫的耐受能力[12]。由于砧木对果树生长、适应性、抗性、果实品质和产量等具有诸多重要影响[13]，在过去的30余年里，发达国家核果类果树栽培从利用实生砧木向重视无性系砧木转变[14]，加速了远缘杂交种和李属其他种作为桃、杏、李、樱桃等核果类果树树种砧木的应用，一些易于无性繁殖且具有矮化作用的李、杏砧木得到广泛应用[15]。中国李、杏砧木研究起步较晚，与世界发达国家差距较大，生产上长期沿用普通杏、山杏、山桃和李等实生砧木，缺乏无性系砧木良种，生产的果品商品性不高，制约了产业的发展[16]。为此，北京市林业果树科学研究院从欧洲引进了一批具有矮化、易无性繁殖、适应性强等特性的李杏砧木。

流式细胞术(Flow cytometry, 简称FCM)是20世纪70年代发展起来的一种集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术为一体的细胞分析技术，目前已经广泛应用于细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等多个研究领域[17]。植物倍性鉴定是植物资源评价的重要内容，对于植物资源的开发利用具有重要意义。在植物倍性鉴定研究中，流式细胞术与传统染色体计数法、形态观察法相比，具有操作技术简单、用时短、效率高、鉴定结果准确等特点，因此，自1987年Delaat等[18]首次报道使用流式细胞术鉴定植物倍性以来，该方法已成为鉴定植物倍性的常用方法[19]，中国许多学者利用流式细胞术对不同树种进行了倍性鉴定研究。如韩莎等[20]对不同倍性桑树品种及经过秋水仙碱或60Co-γ射线诱导的桑树诱变植株进行倍性鉴定，并与染色体计数结果进行比较；赵奉彬等[21]进行11种杨属植物的倍性鉴定，并确定了山杨天然三倍体；赵青等[22]确定5种木兰科植物的DNA-C值及其倍性；此外，流式细胞术也被应用于苹果[23]、猕猴桃[24]、桃[25]、梨[26-27]和香蕉[28-29]等果树树种及樱桃砧木[30]的倍性鉴定。

本研究以150份杏、7份李和9份引进李杏砧木资源为试材，利用流式细胞术开展倍性鉴定，以明确其倍性水平，发掘多倍体资源，为进一步开展相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以150份杏(编号1-150)、7份李(编号151-157)、9份引进砧木(编号158-166)种质资源幼嫩叶片为试材，采集生长季节新梢顶部初展叶片，分别用自来水和蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分，备用。所有材料均采自北京市林业果树科学研究院杏和李种质资源圃，栽培管理水平一致。150份杏资源包括普通杏及其变种、西伯利亚杏及其变种、仁用杏、紫杏和辽杏等种质类型；7份李资源包括杏李、黑刺李和欧洲李等种质类型；9份砧木资源包括乌荆子李、远缘杂交种质和未知类型种质。

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 流式细胞术鉴定150份杏样品DNA相对含量与倍性水平

以二倍体‘巴斗’为外标，利用流式细胞术对150份杏种质资源进行倍性鉴定结果见表1。由表1可知，供试150份杏样品CV值为1.80～ 5.10，数据质量较好；G0/G1期荧光强度峰值 36.81～56.39，DNA相对含量77.07%～ 118.07%，样品与对照G0/G1期荧光强度峰值比值均近似1，全部为二倍体。

表1 以二倍体‘巴斗’为参照的150份杏种质资源的FCM分析Table 1 FCM analysis of 150 accessions of apricot germplasm resources with diploid ‘Badou’ as external reference

(续表1 Continued table 1)

(续表1 Continued table 1)

2.2 流式细胞术鉴定16份杏近缘植物种质资源DNA相对含量与倍性水平

以‘巴斗’为外标，利用流式细胞术对16份杏近缘种质资源进行倍性鉴定，结果见表2。由表2可知，供试16份样品CV值为1.80～4.65，数据质量较好；G0/G1期荧光强度均值为36.38～162.83， DNA相对含量为76.17%～ 340.93%，其中杏李品种‘坤洛红美’、杂交杏李品种‘味帝’‘味厚’‘风味玫瑰’及李杏砧木品种‘HY-KL-A’‘KR.’‘PU.’‘ISHTRAR’‘L2’的G0/G1期荧光强度峰值与‘巴斗’相近，位于横坐标50左右位置，其倍性水平与‘巴斗’相同，为二倍体；李杏砧木品种‘JASPI’的G0/G1期荧光强度峰值位于横坐标100左右，其倍性水平是‘巴斗’的二倍，为四倍体；欧洲李品种‘VALOR’‘OULINSKA’、黑刺李及李杏砧木品种‘ FE.’‘GF655-2’和‘S2’的G0/G1期荧光强度峰值位于横坐标150左右，其倍性水平是‘巴斗’的三倍，为六倍体。

表2 以二倍体‘巴斗’为参照的16份杏近缘种的FCM分析Table 2 FCM analysis of 16 accessions from wild relatives of apricot with diploid ‘Badou’ as external reference

部分样品荧光强度直方图结果见图1。图1中直方图每个通道的核数量，直观地反应了相对的荧光强度值，同时表示每个样品的DNA相对含量。图中横坐标代表DNA相对含量，纵坐标代表细胞核数量。图1-a为流式细胞术对二倍体杏品种‘巴斗’鉴定结果，可见其G0/G1期峰值位于横坐标50左右位置；图1-b、1-c、1-d分别为‘味帝’‘坤洛红美’和‘L2’流式细胞术鉴定结果， G0/G1期峰值在横坐标位置均与‘巴斗’相近，为二倍体；图1-e为‘JASPI’流式细胞术鉴定结果， G0/G1期峰值在横坐标100左右位置，是对照‘巴斗’的二倍，为四倍体；图1-f为‘S2’ 流式细胞术鉴定结果，G0/G1期峰值在横坐标150左右位置，是对照‘巴斗’的三倍，为六倍体。

3 讨论与结论

3.1 对照样品与试验材料选择

应用流式细胞术(FCM)进行常规的倍性鉴定分析时，多采用外标(External reference/Separate standard)，即参照样本独立检测，参照样本一般应满足倍性已知、与目标样本染色体结构相似两个条件[32]。本研究选择杏品种二倍体‘巴斗’为参照样本，应用流式细胞术鉴定出150份杏及16份杏近缘植物种质资源倍性。

关于试验材料，利用流式细胞术进行倍性鉴定多选择分生能力强、杂质含量相对较少、比较容易取得的植物器官，如组培苗、茎尖、休眠枝条水培获得的嫩叶等。本研究选用田间自然生长的幼嫩叶片，材料供应时间长、数量多、取材容易；因为实验室距离采样地点近，所有材料均是即采即清洗后即用，检测时碎片峰少、荧光强度峰清晰，效果较好。若检测样本量大、采样地点距离遥远，试验材料需要低温保存，但保存时间不宜过长[9]。

3.2 利用流式细胞术鉴定植物倍性水平结果的判断

目前，利用染色体计数法鉴定植物倍性水平最为直接、可靠，但是该方法对试验材料、操作技术都有较高要求，且过程繁琐、效率较低；利用流式细胞术进行倍性鉴定，可以短时间内完成较多样本检测，大大提高了工作效率，且通过前人对桑[20]、苹果[23]、樱桃砧木[30]等树种应用染色体计数法与流式细胞术倍性鉴定结果进行比较，证明了后者的可靠性。

但是用于流式细胞术的试验材料多为生长、分裂旺盛的植物器官，如嫩叶，应用流式细胞术进行倍性检测时，其G2/M期荧光强度峰值 G0/G1期2倍荧光强度峰值重叠，造成混倍体的假象，影响对样本倍性的判断。为此，本研究通过增加样本检测重复次数、增加每次检测细胞数量以及与对照样品峰值的比较等措施来判断检测样本的倍性，提高了准确性。

3.3 杏及其近缘植物倍性鉴定与多倍体砧木的发现

蒲富慎等[7]观察普通杏和西伯利亚杏2个类型的18份杏种质资源染色体数目，皆为二倍体；林盛华等[8]利用染色体计数法对中国5个种422份杏种质资源进行倍性鉴定，发现除‘泰安杏梅’为三倍体外，其他均为二倍体，而后续研究[10,33]证明‘泰安杏梅’为李与杏的杂交种质,且与李的亲缘关系更近；李雯雯等[9]用流式细胞术进行新疆野杏两个居群20份样品的倍性鉴定，供试样品均为二倍体。本研究用流式细胞术对来自中国东北、华北、西北生态群及日本、美国和欧洲的150份杏种质资源进行倍性鉴定，供试样品皆为二倍体，没有发现多倍体或嵌合体资源。本研究与前人研究[7-10.33]相比，试验材料地理分布更广泛、基因型更丰富。

蒲富慎等[7]观察16份李种质资源染色体数目，结果表明只有欧洲李品种‘晚黑’为六倍体，其余包括中国李、美洲李、樱桃李、乌苏里李和沙樱李×欧洲李等5个类型的15份资源均为二倍体。本研究所用7份李资源中，2份欧洲李为六倍体，1份杏李为二倍体，与前人报道[2,10]一致；1份黑刺李资源为六倍体，与前人报道[2,10]不同，可能是供试材料个体差异导致，其原因有待进一步明确；3份以李与普通杏多代人工杂交获得的杏李资源均为二倍体，此前未见对该类型李资源倍性鉴定报道。据报道，3个杏李品种‘味厚’[3]‘味帝’[4]和‘风味玫瑰’[5]都是欧洲李与普通杏的杂交后代，本研究结果证明这一观点是错误的：欧洲李为六倍体、普通杏为二倍体，其后代不应为二倍体；欧洲李遗传基础狭窄，不易与其他李种杂交[10]，与杏杂交更困难，因此引进杏李资源的亲本有待进一步明确。

本研究通过对9份引进的李杏砧木资源的倍性鉴定，发现4份多倍体资源，未来经过进一步研究，比如观察它们在中国不同地区的表现、适应性、与栽培品种嫁接亲和性及对生长结果的影响等，有望对中国李、杏矮化密植和抗逆栽培起到积极作用，进而促进产业发展。