4种抗生素用于干木耳组织分离方法的评价

2021-10-30陈艳琦吕艳聪贾培松张芳芳

新疆农业科学 2021年4期

陈艳琦，吕艳聪，贾培松，张芳芳，田龙，宋冰，李玉

(1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；2.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；3.嘉兴市经济菌物新种质资源创制重点实验室，浙江嘉兴 314000)

0 引言

【研究意义】黑木耳(AuriculariaheimuerF.Wu et al.)和毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)[1]在我国栽培历史悠久，野生种质资源广泛分布在全国各地。木耳是一种市场广阔的木腐食药用菌[2]，作为特色农产品干木耳已跻身我国出口蔬菜排名前10位[3]，随着产业规模的逐渐扩大，木耳已成为世界上第三重要的栽培食用菌[4]。筛选出4种抗生素用于干木耳组织分离方法，为木耳类胶质菌种质资源的收集提供简便的操作方法和重要的参考依据。【前人研究进展】木耳类真菌菌种获得的方法主要有3种：孢子分离法、基物分离法(也叫菇木分离法、耳木分离法、寄主分离法)以及组织分离法。1960年之前以孢子分离法为主，如银耳栽培使用孢子做菌种[5]。对银耳有伴生菌[6]、木耳为异宗结合担子菌研究发现，不同孢子携带的遗传物质不同，而后孢子分离法主要用于获得单胞菌株作为进行遗传育种的重要研究材料[7,8]。在1980～1990年间认为基物分离法成活率高、操作简单，因此，使用较多，在消毒方法上可使用升汞浸泡消毒[9,10]和火焰灼烧表面消毒[11]，也可直接取中心菇木或菌袋中心小块进行分离[12]。1980年开始逐渐探索应用的组织分离法包括：原基分离、鲜耳片分离、干耳片泡发后分离和干耳片分离。原基分离法是通过环境调节使种瓶(袋)产生原基或幼小子实体，在无菌环境下打破种瓶(袋)取新鲜组织的小块培养的方法[13,14]。鲜耳分离法是通过选取朵大新鲜的耳片，在无菌条件下使用无菌水进行反复冲洗或浸泡，再使用剪刀、小刀剪成小块培养的方法[10]，也可使用链霉素溶液浸泡后培养[15]，或以酒精、升汞等消毒处理后撕开，取菌肉小块胶质培养[16]。干耳片萌发能力被发现后，开始使用自然晒干或低温烘干的干耳片进行组织分离。消毒方法有：使用甲醛、高锰酸钾等消毒药剂熏蒸干耳后取小块培养[17,18]；酒精擦拭干耳，取小块于火焰外焰快速穿梭2～3次后培养[19]；将干耳取小块浸泡于含有青霉素、链霉素的酒精溶液中分离[20]。随着抗生素在组织分离研究方面的应用，添加一定剂量青霉素、链霉素于试管[21]、平板[22]中以提高菌种分离成功率的方法逐渐引用到木耳类真菌组织分离中。【本研究切入点】干耳分离法是木耳菌种收集的快速高效方法，但目前存在使用的抗生素单一、方法不明确、缺乏组织分离前耳片干制方法研究的问题，对木耳不同结构的萌发能力缺乏研究。研究并筛选出4种抗生素的使用方法及用于木耳的干制条件。【拟解决的关键问题】通过设置4种抗生素的不同使用条件，4种常用抗生素酒精溶液的配制方法及处理时间，研究高温处理干耳片对萌发活性的影响和高温处理适宜时间筛选，为高效收集木耳菌种资源提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 木耳

采自吉林农业大学菌菜基地耳片完整、无病虫害发生的栽培玉木耳、毛木耳(毛木耳781)、黑木耳(黑山)子实体；用于验证筛选条件的野生及栽培子实体11份，其中毛木耳4份、玉木耳3份、黑木耳4份。表1

表1 验证筛选条件的样品信息Table 1 Information of sample

1.1.2 试剂和仪器

注射用青霉素钠160万单位/瓶、注射用硫酸链霉素100万单位/瓶、注射用头孢曲松钠1 g/瓶、硫酸庆大霉素注射液2 mL/瓶、葡萄糖、琼脂粉、75%医用酒精。福瑞特770C果蔬烘干机、LEICA M165 连续变倍实体显微镜及成像系统。

1.2 方法

1.2.1 消毒剂配制

消毒剂1：使用一次性灭菌注射器抽取75%酒精4 mL，注入青霉素药瓶并反复抽取使充分混匀，分别抽取0.5、1、1.5和2 mL注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成约3、6、9和12 mg/mL的试剂。消毒剂2：使用一次性灭菌注射器抽取无菌水5 mL，注入链霉素药瓶并反复抽取使充分混匀，分别抽取1、2、3和4 mL注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成5、10、15和20 mg/mL的试剂。消毒剂3：使用一次性灭菌注射器抽取无菌水5 mL，注入头孢曲松钠并反复抽取使充分混匀，分别抽取1、2、3和4 mL注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成5、10、15和20 mg/mL的试剂。消毒剂4：使用一次性灭菌注射器抽取0.5、1、1.5和2 mL的庆大霉素注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成0.5、1、1.5和2 mg/mL的试剂。

1.2.2 组织分离

将自然晒干的样品1，于超净工作台内用灭过菌的镊子掰取0.3～0.6 cm2大小组织块，置于配好的4种消毒剂中，分别浸泡1、3和 5 min，使用镊子取出并迅速通过酒精灯火焰外焰2～3次，转入装有PDA培养基的培养皿中，每个平板放置2个组织块，5次重复。图1

图1 干耳片组织分离操作步骤示意Fig.1 Tissue isolation schematic diagram of dry fruiting bodies

1.2.3 污染率、萌发率统计

组织分离后置于25℃恒温培养箱中避光培养。72 h后观察组织块污染及萌发情况，记录污染率、萌发率及污染类型。

1.2.4 烘干温度筛选

将新鲜子实体分别置于35、45、50、60和70℃烘干箱内烘干至恒重，按照1.2.2方法进行分离，每个平板放置3个组织块，5次重复。

1.2.5 烘干时间筛选

将新鲜子实体置于65℃烘干箱内，分别于烘干4、8、12和16 h后取出，按照1.2.2方法进行分离，每个平板放置3个组织块，5次重复。

1.2.6 不同抗生素适用性验证

将筛选后获得的适宜用于木耳组织分离的方法进行验证。使用13份验证样品，按照1.2.2方法进行分离，设置75%酒精和无菌水浸泡3～5 min作为对照，每个平板放置5个组织块，4次重复。

1.2.7 组织分离的萌发面

验证样品Ac3、Ac6，按照1.2.2方法进行分离，后置于25℃恒温培养箱中避光培养，每12 h在LEICA M165连续变倍实体显微镜下，对分离的组织块的菌丝萌发部位进行观察记录。

1.3 数据处理

应用Excel 2007对数据进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 4种抗生素适宜处理使用方法

2.1.1 消毒剂1使用浓度及处理时间筛选

研究表明，3 mg/mL消毒剂1在浸泡1和5 min处理均出现细菌污染，虽然萌发率较高但组织块萌发的同时也被细菌污染，低浓度不能较好的解决细菌污染问题；6 mg/mL消毒剂1在浸泡1 min处理也出现细菌污染，但随着浸泡时间延长，再无细菌污染；12 mg/mL消毒剂1在浸泡3 min处理时出现霉菌污染，而目前霉菌污染无法通过使用抗生素来解决。当浓度6 mg/mL时，浸泡3～5 min就可以完全去除细菌的影响，可作为青霉素适宜使用浓度和时间。表2

2.1.2 消毒剂2使用浓度及处理时间筛选

研究表明，5和10 mg/mL消毒剂2在浸泡1和3 min处理均出现细菌污染，虽萌发率相对较高，但浓度较低时不能较好的控制细菌污染问题，20 mg/mL消毒剂2在浸泡3和5 min处理也出现细菌污染且萌发率较低，应与链霉素在75%酒精中具有析出现象有关，并且随着浓度升高析出现象加重，甚至高浓度浸泡处理的部分组织块在取出时会粘有沉淀，影响了组织块萌发。浓度15 mg/mL浸泡1～3 min作为链霉素适宜使用浓度和时间。表3

2.1.3 消毒剂3使用浓度及处理时间筛选

研究表明，10 mg/mL消毒剂3在浸泡1和3 min处理均出现污染，其他处理均未出现污染；5 mg/mL消毒剂3在不同浸泡时间处理后的萌发率均低于其他浓度；15 mg/mL消毒剂 3 处理不同时间后均无污染且萌发率较高。头孢曲松钠在75%酒精中也有析出现象，浓度越高析出越明显。结合污染率和萌发率分析，低浓度、短处理时间不能较好抵抗细菌污染，浓度15 mg/mL浸泡3～5 min是头孢曲松钠的适宜使用浓度和时间。表4

表2 消毒剂1不同处理组织分离污染率及萌发率Table 2 Germination and contamination rate of tissue isolation disinfected with reagent 1

表4 消毒剂3不同处理组织分离污染率及萌发率Table 4 Germination and contamination rate of tissue isolation disinfected with reagent 3

2.1.4 消毒剂4使用浓度及处理时间筛选

研究表明，0.5和1 mg/mL消毒剂4在浸泡1、3和5 min处理中均出现污染，虽然萌发率较高，但细菌污染率也较高，且随着浸泡时间的增加污染率增高，因此，过低浓度的消毒剂4不适合用于木耳组织分离；1.5和2 mg/mL消毒剂4不同浸泡时间处理中均未出现细菌污染，但2 mg/mL长时间浸泡萌发率降低，浓度1.5 mg/mL浸泡1～3 min是庆大霉素的适宜使用浓度和时间。表5

2.2 组织分离最适烘干条件

研究表明，通常用于组织分离的样品，使用自然干燥处理，以在不同烘干温度条件下获得的干耳为材料，使用6 mg/mL消毒剂1浸泡3～5 min的方法组织分离。新鲜样品及时烘干储存后分离，随着烘干温度的增加，萌发率并未降低，说明适当的较高温度烘干对木耳组织分离成功率影响较小。表6

表5 消毒剂4不同处理组织分离污染率及萌发率Table 5 Germination and contamination rate of tissue isolation disinfected with reagent 4

表6 不同烘干温度组织分离萌发率污染率Table 6 Germination and contamination rate of tissue isolation in different drying temperatures

研究表明，65℃烘干时，随着烘干时间的增加，样品2萌发率均呈现下降趋势，其中玉木耳、毛木耳在65℃烘干12 h时萌发率为 0，黑木耳萌发率43.75%，当烘干时间达到16 h时样品2均无法萌发。烘干时间对于木耳的萌发率影响较大，虽然烘干处理12、16 h的木耳组织块在培养基上仍能够复水泡发，但持续培养30 d仍不能萌发出菌丝。木耳样品的处理可以选择在65℃条件下烘干4～8 h，密封保存，再到具备实验条件时进行组织分离，短时间内获得能够分离菌种的木耳样品。表7

表7 65℃不同烘干时间组织分离污染率及萌发率Table 7 Germination and contamination rate of tissue isolation with different drying time at 65℃

2.3 干木耳组织分离方法验证

研究表明，使用11份样品对筛选到的不同抗生素使用方法进行验证，同时进行75%酒精和无菌水处理。无菌水和75%酒精处理样品几乎全部出现细菌，无菌水样品8份出现霉菌，75%酒精处理有5份出现霉菌，4种消毒剂处理，污染率明显下降萌发率提高，不同样品间的差异说明了样品本身携带的杂菌基数、采集环境和储藏条件对组织分离成功率的影响较大。

组织分离30～36 h即可在组织块周围观察到部分污染菌落，48 h即可观察到部分样品组织块明显萌发，其中栽培样品萌发时间较野生样品短，3 d后统计发现，总体表现为栽培样品的菌落直径大于野生样品，这应与菌株对培养基的适应性有关。以ITS通用引物ITS1/ITS4对获得的部分菌株及样品进行PCR验证，经过NCBI比对均为目标菌株。

3份玉木耳干品，均使用自封袋封存于20～25℃干燥环境下保存，Ac6和Ac5萌发，验证了高温烘干或自然干燥的玉木耳，常温保存1年仍具有萌发菌丝的能力，Ac6萌发率较高，而相同采收时期使用高温烘干的Ac5，萌发率相对较低，推测自然晾晒相比于高温烘干更适合长期保藏耳片。Ac7由于受到了长期的日照处理，虽然组织块在培养基上仍能泡发但观察30 d未萌发。图2，表8

注：红色箭头指向霉菌污染，绿色箭头指向细菌污染Note：Red arrow points to mould contamination,green arrow points to bacterial contamination图2 不同消毒方法组织分离Fig.2 Isolation results by different disinfection methods

2.4 组织分离的萌发面

研究表明，不同样品均具有组织块周身可萌发的情况，为方便对木耳的绒毛进行观察，选择使用6 mg/mL消毒剂1处理的Ac3、Ac6组织块进行观察。48 h时可观察到明显的萌发菌丝(图3A)，组织块的可育层(光滑面)(图3B)、菌肉(图3C)、不育层(毛面)(图3D)均出现细小菌丝。观察到的萌发菌丝细弱且弯曲，其中可育层与菌肉萌发出的菌丝致密较易观察，而不育层因为存在绒毛使得细弱菌丝不易分辨，在绒毛上也发现有细弱菌丝。从组织块上萌发的菌丝，在接触培养基后菌丝生长速度提高，菌丝形态白壮致密(图3E)。由于操作过程中需快速通过火焰，在显微观察中发现有绒毛被灼伤(图3F)，但该组织块仍可萌发。图3

注：A:Ac3萌发组织块：B:Ac3可育层萌发菌丝：C:Ac3菌肉萌发菌丝：D:Ac3绒毛萌发菌丝：E:Ac6萌发组织块：F:Ac6灼伤绒毛Note:A:Germinated tissue piece of Ac3:B:Germinated fertile layer of Ac3:C:Germinated context of Ac3:D:E:Germinated tissue piece of Ac6:F:Burnable of Ac6图3 组织块萌发面Fig.3 Microscopic observation of tissue piece germination surface

3 讨论

研究涉及的消毒方法，包括4 种常用抗生素以及75%酒精。其中青霉素在组织分离中应用最早且广泛[19-21]，链霉素也被报道应用于木耳[22]、秀珍菇[23]等食用菌的组织分离，头孢曲松钠对荔枝霜疫霉菌等有害病菌也具有抑制作用[24]，而庆大霉素由于具有耐热性，可于培养基灭菌前加入[25]。作为种质资源收集的重要方法，组织分离也用于巩固优良菌株的遗传特性和品种复壮效果[26,27]，但也存在可能携带病毒的情况[28]，组织分离获得的菌株必须通过栽培试验才可用于生产。

经过使用方法筛选试验后，以11 份不同样品进行验证，同时对比无菌水、75%酒精和4种消毒剂处理，发现75%酒精比无菌水处理，可能会减少霉菌的发生，对细菌也有一定的抑制作用，部分样品如Ac1、Ac2、Ah1在75%酒精处理下虽然被细菌污染，仍有较高的萌发率，这可能与木耳本身具有抗菌功能有关[29]，4 种抗生素有效降低了污染率，尤其是减少细菌污染，但对霉菌污染无明显抑制作用。经试验该方法也适用于干银耳的组织分离，可在平板上获得干银耳泡发后再分化的黄白色子实体。

在试验操作过程中发现：(1)由于玉木耳、毛木耳较黑木耳肉厚较韧，因此在掰取组织块时更费力，黑木耳耳片较薄易掰碎；(2)除青霉素外的3种抗生素均在酒精溶液中呈现析出现象，溶解性青霉素>头孢曲松钠>庆大霉素>链霉素，随着抗生素浓度升高析出现象加重，甚至高浓度浸泡处理的部分组织块在取出时会粘有沉淀，影响了组织块萌发，因此，配制易析出消毒剂时注意混匀并及时使用；(3)可使用60 mm玻璃平板或其他灭菌玻璃容器操作，保持消毒剂浓度使组织块没过消毒剂即可，一次配药可分离多份样品，以减少抗生素排放[30]。

菌物研究过程中发现部分真菌也会受到抗生素的抑制，比如在构建遗传转化中常用的潮霉素、卡那霉素等，还有如多菌灵、咪鲜胺等真菌抑制剂[24]，除所选用的4种常用抗生素外，氯霉素对细菌也有较好抑制效果可考虑使用[31,32]。研究的4种抗生素没有表现出对木耳菌丝的抑制作用，但使用抗生素及真菌抑制剂对菌株的生物学特性、酶活性、栽培性状等方面是否存在影响，还需进一步讨论。

干耳组织分离成活率受干燥方式、保存时干耳含水量、保存条件和霉菌污染情况等因素的影响。以往报道中鲜耳可使用低温鼓风干燥[33]、自然晒干或28℃烘干[19]获得干耳后组织分离，试验中65℃烘干玉木耳常温保存1年仍可萌发菌丝，这与孟秀秀和李晓[34]关于自然晒干黑木耳可保存1年后组织分离的研究结果一致。木耳孢子在PDA培养基的萌发时间约为5 d[35]，因此可育层(光滑面)萌发菌丝非孢子萌发，且干木耳的不同部位均可萌发，这与鲜耳组织分离中使用菌肉分离研究一致[16]。不同萌发面菌丝的萌发时间、生长速度不仅与样品本身有关，也与该萌发面所受物理损伤、是否能够直接接触培养基有关。通过观察推测绒毛也具有分化出菌丝的能力，但不同萌发面萌发的菌丝间是否有差异，是否能够发育出子实体完成生活史等还需要进一步研究讨论。