红细胞分布宽度、miR-130a与乙型肝炎肝硬化并发消化道出血及病情进展的关联性*

孙喜斌，张玉虹，左路广，贾 倩，连晶晶，冯 博，高咏梅，张 斌

河北北方学院附属第一医院检验科，河北张家口 075000

肝硬化是慢性乙型肝炎(下称乙肝)患者发展的终末阶段，而消化道出血(GB)则是乙肝肝硬化最凶险的并发症之一，具有起病急骤、复发率高、预后不良等特点，若未予以及时有效地干预，短期内大量出血会引发失血性休克，严重者甚至死亡[1-3]。目前临床尚未完全明确乙肝肝硬化并发GB的病理机制，有相关研究认为[4-5]，肝脏是造血的主要器官，以生成红细胞为主，肝硬化后，肝脏正常结构发生改变，可能导致红细胞系统异常，从而引发不同程度的贫血现象。红细胞分布宽度(RDW)是评价外周血红细胞体积异质性的定量指标[6]。另外，有研究表明[7]，微小RNA(miRNA)作为调控基因表达的重要因子，可能参与肝硬化并发上消化道出血的发生、发展。miR-130a属miRNA的一种，具有抗病毒、抗感染等作用，高飞等[8]研究认为，其可作为评估乙肝病毒相关肝脏衰竭的病情程度以及预后中提供数据支持，但关于其与RDW联合对乙肝肝硬化并发GB的诊断价值临床鲜少报道。因此，本研究尝试分析RDW、miR-130a与乙肝肝硬化并发GB及其病情进展的关联性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2020年9月本院204例乙肝肝硬化患者，根据有无GB分为GB组(n=71)与非GB组(n=133)。其中GB组女50例，男21例，年龄47～73岁，平均(58.74±5.20)岁；Child-Pugh分级：10例A级，18例B级，43例C级；非GB组：女101例，男32例，年龄48～75岁，平均(59.05±4.68)岁；Child-Pugh分级：20例A级，32例B级，81例C级。两组基本资料(年龄、性别、Child-Pugh分级)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。

纳入标准：(1)GB组伴有呕血和(或)黑便等临床表现，并经胃镜检查证实；(2)两组均符合乙肝肝硬化相关标准[9]。排除标准：(1)合并原发性血液系统疾病者；(2)近期有食管曲张静脉套扎或门体分流及其他治疗者；(3)近12周内有抑酸类药物、抗菌药物或非甾体消炎药等服用史者；(4)合并肝癌或其他恶性肿瘤者；(5)合并心脑等其他重要脏器器质性损害者；(6)精神行为失常者。本研究经过本院伦理委员会经审核评议通过，所有研究对象均知情，并签订同意书。

1.2方法 (1)空腹取8 mL静脉血，通过XS-500i全自动细胞分析仪测定RDW，严格按照日本美康公司提供的仪器说明书操作；1 000×g离心12 min(离心半径10 cm)，分离取血清，置于-20 ℃低温保存。(2)肝功能指标：采用BS-480全自动生化分析仪测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，严格按照深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供的仪器说明书操作。(3)miR-130a表达：利用美国Ambion公司提供的mirVana miRNA分离试剂盒提取血清总RNA，使用美国Thermo Scientific公司提供的Nanodrop 2000分光光度计检测RNA纯度。根据GenBank数据获取待测基因序列，并按照实时荧光定量PCR引物设计原则以Primer 5.0软件设计引物，以β-actin为内参基因，上游引物为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；miR-130a上游引物：5′-AGT CTA TAC AAG GGC AAG CTC TC-3′；下游引物：5′-CCC AAT ACG ACC AAA TCC GTT-3′。反应体系：上、下游引物各0.4 μL、超级酶混合物0.2 μL、去RNA水3.4 μL、RNA模板0.6 μL、RT-qPCR缓冲液5 μL。扩增体系：93 ℃预变性5 min；93 ℃ 40 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共40个循环。血清miR-130a相对表达量以2-ΔΔCt计算。

1.3乙肝肝硬化并发GB病情程度评估标准[10]头晕，失血量<500 mL，收缩压(SBP)基本正常、心率(HR)正常，血红蛋白(Hb)未改变，休克指数(HR/SBP)=0.5为轻度；晕厥、口渴、少尿，500 mL≤失血量≤1 000 mL，SBP降低，HR>100 次/min，70 g/L≤Hb≤100 g/L，0.5<休克指数≤1.0为中度；失血量>1 000 mL，SBP<80 mm Hg，HR>120次/min，Hb<70 g/L，肢冷、少尿、意识模糊，休克指数>1.0为重度。

1.4观察指标 (1)比较两组肝功能指标(AST、ALT、GGT)、RDW、miR-130a表达。(2)分析肝功能指标与RDW、miR-130a表达相关性。(3)分析RDW、miR-130a单一及联合对乙肝肝硬化并发GB的诊断效能。(4)比较GB组不同病情程度患者的临床资料，包括性别、年龄、Child-Pugh分级、脾脏厚度、腹水、胃左静脉内径、门静脉内径及食管静脉曲张，其中脾脏厚度、腹水、胃左静脉内径、门静脉内径均采用彩色多普勒超声诊断仪(购自美康电子设备有限公司)测定；食管静脉曲张予以胃镜观察。(5)比较GB组不同病情程度患者肝功能指标(AST、ALT、GGT)、RDW、miR-130a表达。(6)分析乙肝肝硬化并发GB病情的影响因素。

2 结 果

2.1两组肝功能指标、RDW、miR-130a表达 GB组AST、ALT、GGT、RDW水平均高于非GB组，miR-130a相对表达水平低于非GB组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组肝功能指标、RDW、miR-130a表达对比

2.2肝功能指标与RDW、miR-130a表达相关性 GB组RDW与AST、ALT、GGT呈正相关关系(r=0.701、0.673、0.558，P<0.05)，miR-130a表达与AST、ALT、GGT呈负相关关系(r=-0.730、-0.666、-0.629，P<0.05)。见图1～6。

图1 RDW与肝功能指标AST相关性

2.3RDW、miR-130a表达对乙肝肝硬化并发GB的诊断效能 ROC曲线显示，RDW、miR-130a表达联合诊断乙肝肝硬化并发GB的AUC最大，为0.771，灵敏度、特异度分别为77.46%、68.42%。见表2，图7。

图7 ROC曲线

表2 RDW、miR-130a表达对乙肝肝硬化并发GB的诊断效能

图2 miR-130a表达与肝功能指标AST相关性

2.4GB组不同病情程度患者临床资料 GB组不同病情程度患者年龄、Child-Pugh分级、脾脏厚度、腹水、胃左静脉内径、门静脉内径及食管静脉曲张情况相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图3 RDW与肝功能指标ALT相关性

图4 miR-130a表达与肝功能指标ALT相关性

图5 RDW与肝功能指标GGT相关性

2.5GB组不同病情程度患者肝功能指标、RDW、miR-130a表达 GB组不同病情程度患者肝功能指标AST、ALT、GGT、RDW、miR-130a相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 GB组不同病情程度患者临床资料对比[n(%)]

表4 GB组不同病情程度患者肝功能指标、RDW、miR-130a表达对比

图6 miR-130a表达与肝功能指标GGT相关性

2.6乙肝肝硬化并发GB病情的影响因素 以乙肝肝硬化并发GB病情为因变量(赋值：轻度=1，中度=2，重度=3)，将表3、4中有差异因素纳入Logistic回归分析，结果显示，Child-Pugh分级、脾脏厚度、腹水、胃左静脉内径、门静脉内径及食管静脉曲张、RDW、miR-130a均为乙肝肝硬化并发GB病情的影响因素(P<0.05)。见表5。

表5 乙肝肝硬化并发GB病情影响因素

3 讨 论

有研究报道[11]，肝硬化并发GB患者病死率可达15.00%～29.00%。因此，及早明确乙肝肝硬化并发GB病情程度，予以有效治疗措施，对预后改善至关重要。

RDW是红细胞体积检测主要参数之一，与红细胞玻片镜检本比较，在诊断缺铁性贫血方面更具客观性与准确性[12-13]。本研究经全自动细胞分析仪检测可知，RDW表达在乙肝肝硬化并发GB患者中过度上调，并与AST、ALT、GGT存在正相关关系。结合李海深等[14]、宋怡然等[15]研究考虑这可能归因于一方面，乙肝肝硬化时，肝脏解毒功能损伤，不仅会加重肝损伤程度，分泌大量炎症细胞，激活炎症级联反应，影响红细胞生长发育，还会引起门静脉高压，诱导脾功能亢进，破坏红细胞正常功能，缩短红细胞寿命，从而上调RDW；另一方面，肝硬化消化道出血所致急性或慢性失血，会引发失血性贫血，降低铁水平，主要表现为小细胞低色素贫血。由此推测，RDW可能在乙肝肝硬化并发GB发生、发展中起着重要作用。RDW有望成为乙肝肝硬化并发GB诊断的潜在指标，有助于指导临床诊治。另外，秦娇等[16]经多变量分析发现，RDW是乙型肝炎病毒相关慢性与急性肝衰竭患者短期死亡的独立危险因素。LOU等[17]认为，RDW在各类乙肝患者中均显著升高，并与疾病严重性存在正相关性。本研究通过多因素Logistic回归分析显示，RDW高水平是乙肝肝硬化并发GB病情程度的独立危险因素，与孙喜斌等[18]研究存在相似性，说明RDW可反映乙肝肝硬化并发GB病情程度。

miR-130a属miR-130家族之一，近年来有报道指出[19]，其不仅能控制淋巴细胞定向转移，调节淋巴细胞趋化性，刺激中性粒细胞、上皮细胞趋化因子受体表达，还能在PI3K/Akt/PTEN/mTOR等耐药信号转导途径中起中介作用。本研究经分组对比研究提示，miR-130a在乙肝肝硬化并发GB患者中呈低表达，并随病情程度加重出现下降趋势，与霍续磊等[20]研究结果不一致，可能与二者研究对象不同有关。上述结果产生机制可能为乙肝肝硬化并发GB患者病理性免疫反应激活，可造成miRNA-130a下降，促使淋巴细胞锚定融合血管内壁，诱导免疫细胞束缚病变靶细胞，释放白细胞介素1、肿瘤坏死因子-α等炎症因子，最终形成恶性循环。另外，LI等[21]经小鼠模型证明，miR-130a可活化α平滑肌肌动蛋白，诱导内皮向间充质转化，继而在多种病因所致肝损伤或肝衰竭发病过程中发挥重要作用。本研究经Pearson线性相关性分析发现，miR-130a表达与AST、ALT、GGT存在负相关性。表明miR-130a表达下调可能加重肝功能损伤，主要与免疫炎性反应加剧有关，但具体机制有待今后深入分析。然而miR-130a单一诊断乙肝肝硬化并发GB存在一定局限性，故本研究采取联合诊断模式，结果显示，RDW、miR-130a联合诊断乙肝肝硬化并发GB的AUC高于上述指标单一诊断，为0.771。进一步证明了RDW、miR-130a联合在乙肝肝硬化并发GB中的诊断价值。此外，陈炀森[22]研究指出，Child-Pugh分级为C级、食管胃底静脉曲张是肝硬化并上消化出血死亡的独立危险因素；王柳青等[23]认为，胃左静脉内径、食管胃底静脉曲张是肝硬化并发首次上消化道出血致命的独立危险因素，与本研究观点具有相似性。故评估乙肝肝硬化并发GB病情程度的同时应将Child-Pugh分级、脾脏厚度、腹水、胃左静脉内径、门静脉内径、食管静脉曲张等因素纳入考虑范围内，以减少数据偏移。

综上所述，RDW、miR-130a与乙肝肝硬化并发GB患者肝功能存在良好线性关系，也是乙肝肝硬化并发GB病情的重要影响因素，二者联合检测可为临床诊断乙肝肝硬化并发GB、评估病情程度、开展个性化治疗提供一种新途径。