miR-30a和SNAI1基因多态性与糖尿病肾病的相关性分析

杨彩莲，童涛，孙明芳，周波

重庆医科大学附属第一医院内分泌科，重庆 400016

糖尿病肾病(DKD)以持续性蛋白尿或肾小球滤过率(GFR)下降为特征，是导致终末期肾病(ESKD)的主要原因[1-2]。随着糖尿病发病率的上升，尽管临床上使用了各种控制血糖、血压的药物，以及生活方式的干预策略，DKD的发生率仍不断增长[3]。目前研究发现，高血糖、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症反应和多种细胞因子反应均与DKD的发展密切相关，但其机制尚未完全明确[4-7]。多项临床及流行病学研究证实，遗传因素对DKD的发生也有着不可忽视的作用[8-12]。微小RNA(microRNAs，miR)为非编码小分子RNA，可通过参与调控相关基因的表达而影响各种肾脏疾病的发生发展[13-17]，其中miR-30a因在肾脏组织中的高丰度表达而备受关注[18-20]。本课题组既往研究发现，锌指转录因子SNAI1作为miR-30a的潜在靶基因(http://www.targetscan.org/，https://www.mirbase.org/)，在体外高糖环境诱导的足细胞上皮-间质细胞转分化(EMT)过程中明显上调，且具有代谢记忆现象[21]。NCBI基因库数据显示，rs2222722位于miR-30a基因编码区，其多态性可能影响miR-30a的表达与功能。已有研究证实，rs2222722基因多态性与原发性肾病综合征[22]及各种肿瘤[23-25]的发生密切相关。而rs1543442位于SNAI1基因的3′端非编码区，是miR-30a调控SNAI1基因表达可能的功能位点，该位点的基因多态性很可能与SNAI1基因的表达相关。鉴于目前尚未见miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442单核苷酸基因多态性与DKD关系的报道，本研究以表观遗传调节为切入点，采用病例对照设计，探讨miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442单核苷酸基因多态性与中国重庆地区2型糖尿病(T2DM)患者发生DKD的关系，以及DKD在基因水平的危险因素，旨在为早期筛查易感患者并进行干预、延缓DKD的发生和进展提供前期依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2018年10月－2019年9月重庆医科大学附属第一医院内分泌科收治的520例T2DM患者进行回顾性分析，其中240例T2DM合并DKD的患者为病例组，280例T2DM不合并DKD的患者为对照组。DKD的诊断依据为2012年KDIGO指南[26]。纳入标准：(1)根据1999年世界卫生组织公布的糖尿病诊断和分型标准，确诊为T2DM的患者[27]；(2)年龄≥40岁，汉族，相互无亲缘关系；(3)糖尿病病程≥5年。排除标准：(1)有急性应激状态史如手术史、高血糖危象、心力衰竭或尿路感染等；(2)有各种肿瘤、活动性肝脏疾病、遗传性疾病或自身免疫性疾病史；(3)有其他原因引起的肾功能损害并影响尿微量白蛋白/肌酐比值(ACR)者。本研究已获重庆医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批号：2020-480)。

1.2 基因多态性检测 收集外周血400 μl，利用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA blood mini kit，德国Qiagen公司)提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000C分光光度计(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)测量基因组DNA的浓度和纯度。采用TaqMan-MGB探针等位基因特异性杂交法检测miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442的单核苷酸多态性，反应体系包括2 μl DNA、12.5 μl TaqMan PCR酶、10 μl三蒸水、1.0 μl TaqMan FAM探针、1.0 μl TaqMan HEX探针、1 μl正向引物和1 μl反向引物。扩增条件为：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，持续40个周期。用于检测单核苷酸多态性(SNPs)的引物和探针由TaKaRa Bio公司提供(RS2222722探针C FAM-TGTACGCTTTAcGCTGT-MGB，探针T HEX-ATGTACGCTTTAtGCTGTT-MGB，正向引物TAGTCTAAGTTCACTCAACTGCAGTATTTG，反向引物GCAAAAGTGACCAAACACAGAAAC；RS1543442探针A FAM-CヰCCCATGGCCAヰ-MGB，探针G HEX-AAGAGGCCTTCCCGTG-MGB，正向引物TTGATGAAGACCATTTTCTGGTTCT，反向引物GATACAAAAACCCACGCAGACA)，扩增仪器为CFX96实时PCR检测仪(美国Bio-Rad公司)。随机选择DNA扩增样本，由上海生工生物科技公司进行测序，以验证TaqMan-MGB法测定基因型的准确性。结果表明，本研究使用的TaqMan-MGB检测方法准确率为100%。

1.3 DKD的危险因素分析 分析病例组与对照组各临床和生化指标的差异及miR-30a rs2222722、SNAI1 rs1543442基因型的分布情况，筛选出DKD的危险因素，对其临床特征进行分层分析，并分析各临床特征与估算肾小球滤过率(eGFR)和ACR的相关性，然后对miR-30a rs2222722、SNAI1 rs1543442各基因型对DKD的发生是否存在协同作用进行分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。对两个目标位点基因型的分布情况进行Hardy-Weinberg平衡分析。符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验；偏态分布的以M(Q1，Q3)表示，对组间不符合正态分布的连续变量的差异性分析采用非参数检验法。计数资料以例(%)表示，组间比较采用Pearsonχ2检验。采用logistic回归分析对可能影响结果的混杂因素进行调整，分析miR-30a和SNAI1单核苷酸多态性与DKD发生的关系，采用比值比(OR)和95%可信区间(CI)表示各变量对DKD发生的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者临床及生化指标的差异 与对照组比较，病例组患者年龄大，收缩压、脉压差、纤维蛋白原、C反应蛋白和ACR高，糖尿病、高血压病程长，吸烟率、饮酒率和eGFR低；而两组的性别、体重指数(BMI)、舒张压、空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂等指标差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 病例组与对照组一般资料比较Tab.1 Comparison of general characteristics of patients in case and control groups

2.2 miR-30a rs2222722、SNAI1 rs1543442各基因型与DKD的关系 Logistic回归分析结果显示，在显性模型中，miR-30a rs2222722 C等位基因携带者发生DKD的风险是T等位基因携带者的2.61倍(校正95%CI 1.09～6.27，P=0.032)。在隐性模型中，rs2222722 CC基因型携带者发生DKD的风险是CT或TT基因型携带者的2.73倍(校正95%CI 1.61～4.61，P<0.001)。此外，在SNAI1 rs1543442隐性模型中，校正相关混杂因素后，GG基因型也显著增加了携带者发生DKD的风险(校正OR=1.70，95%CI 0.73～1.58，P=0.036)(表2)。

表2 mir-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因型与DKD的关系Tab.2 Correlation of miR-30a rs2222722 and SNAI1 rs1543442 genotype with DKD in diabetic patients

2.3 临床特征分层分析 根据年龄、性别、糖尿病病程、HbA1c和BMI水平对两组研究对象进行分层，分析在不同人群中miR-30a rs2222722(C>T)和SNAI1 rs1543442(G>A)各基因型与DKD之间的相关性。结果显示，miR-30a rs2222722 (C>T)CC基因型与DKD的关系在较年轻(<65岁)、血糖控制较差(HbA1c>8%)、BMI较低(<24 kg/m2)的研究对象中更明显(P<0.05)。SNAI1 rs1543442(G>A)GG基因型与DKD的关系在男性、糖尿病病程<10年、HbA1c<8%和BMI<24 kg/m2的研究对象中更明显(表3)。

表3 临床特征分层分析miR-30a和SNAI1单核苷酸多态性与DKD的关系Tab.3 Stratified analysis of the correlation between the miR-30a SNAI1 SNP and risk of DKD

2.4 miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因型与eGFR和蛋白尿的关系 采用logistic回归法进一步分析miR-30a rs222272和SNAI1 rs1543442不同基因型与eGFR和ACR升高的关系，校正年龄和性别后发现，在miR-30a rs2222722(C>T)隐性模型(TT+CTvs.CC)中，CC基因型携带者较TT+CT基因型携带者更容易发生eGFR下降(OR=2.13，95%CI 1.37～3.32，P=0.001)及ACR升高(OR=1.59，95%CI 1.08～2.34，P=0.019)，且C等位基因携带者发生eGFR降低(OR=1.59，95%CI 1.15～2.18，P=0.005)及ACR升高(OR=1.43，95%CI 1.07～1.91，P=0.015)的风险也明显高于T等位基因携带者。然而，在SNAI1 rs1543442(G>A)隐性和显性模型中，均未见与eGFR降低和ACR升高有相关性(表4)。

表4 miR-30a和SNAI1单核苷酸多态性与eGFR≤60 ml/(min·1.73 m2)和ACR≥30 mg/g的关系Tab.4 Correlation between miR-30a, SNAI1 SNP genotypes and the risk of eGFR ≤60 ml/(min·1.73 m2) and ACR≥30 mg/g

2.5 DKD独立危险因素分析 Logistic回归分析结果显示，miR-30a rs222272的CC基因型和SNAI1 rs1543442的GG基因型是DKD的独立危险因素(表5)。

表5 DKD独立危险因素分析Tab.5 Analysis on the independent risk factors for DKD

2.6 miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因型协同作用分析 进一步分析miR-30a rs222272和SNAI1 rs1543442各基因型间是否存在增加DKD发生风险的协同作用，结果未发现两个位点基因型间存在协同作用(P>0.05，表6)。

表6 miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因多态性对DKD发生的协同作用分析Tab.6 Synergistic effect of miR-30a rs2222722 and SNAI1 rs1543442 polymorphisms on DKD

3 讨 论

本研究结果显示，miR-30a rs2222722(C>T)CC基因型与DKD的发生存在明显相关性。在调整了相关混杂因素后，CC基因型携带者发生DKD的风险是CT和TT基因型患者的2.73倍；进一步探讨miR-30a rs2222722基因型与ACR升高和eGFR水平之间的关系发现，CC基因型携带者较TT或CT基因型携带者更容易发生ACR升高和eGFR降低。

研究发现，足细胞损伤在DKD的发生、发展中具有重要作用，而EMT是DKD足细胞损伤的重要形式[28-31]。细胞发生EMT后细胞间连接和黏附减弱，失去了细胞极性和原始形态，而细胞运动和迁移能力则增强[32-33]。足细胞发生EMT可能是足细胞功能障碍、蛋白尿和肾小球硬化的主要原因[30]。miR-30a以各种方式参与细胞不同的生理生化过程，进而影响细胞的结构与功能，其中也包括细胞EMT过程[34-35]。有研究发现，在不同类型的肾脏疾病(如DKD、局灶节段性肾小球硬化和膜增生性肾小球肾炎)中，人体肾脏穿刺活检发现miR-30a表达水平均明显降低[20]，而足细胞损伤是这些疾病的重要特征。还有研究发现，经阿霉素(ADR)处理后的肾脏足细胞miR-30a表达水平明显降低，当外源性给予miR-30a类似物时，足细胞上皮标记物的表达则明显上调，而间质细胞标记物在miR-30a模拟物的存在下其表达被抑制；当足细胞转染外源性miR-30a抑制剂时，其上皮标记物的表达下调，而间质标记物的表达上调，这表明miR-30a可能对预防足细胞EMT有着不可忽视的作用[36]。此外，有研究发现，在血管紧张素Ⅱ诱导下，miR-30a在小鼠足细胞中的表达明显下调，而给予外源性miR-30a类似物后，小鼠肾小球及足细胞损伤得到明显改善[37]，提示miR-30a对足细胞具有保护作用。

SNAI1 rs1543442的GG基因型也与DKD的发生相关，在隐性模型中，rs1543442 GG基因型携带者发生DKD的风险是AA或AG基因型携带者的1.70倍。作为miR-30a的一个潜在靶基因，SNAI1基因锌指结构域可与钙黏蛋白E(E-cadherin)启动子区域内的CAGGTG序列结合，导致E-cadherin的表达下调，启动细胞EMT过程[38]。据报道，SNAI1基因活化后通过下调E-cadherin抑制了肾小管上皮表型相关蛋白的表达，同时伴有波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原的表达上调，诱导了肾纤维化，因此，抑制SNAI1基因活性可能对抑制甚至逆转肾纤维化有重要意义[39]。且已有研究证实，miR-30a可通过下调SNAI1的表达抑制肝星状细胞的活化和EMT过程，延缓肝脏纤维化[40]。此外，在糖尿病性白内障模型中，miR-30a的上调可使SNAI1、α-SMA及波形蛋白的表达水平降低，并抑制高糖和转化生长因子-β2(TGF-β2)诱导的细胞EMT过程[41]。但本研究结果显示SNAI1 rs1543442多态性与患者的ACR升高或eGFR水平无关；因此，SNAI1与DKD的关系仍需进一步研究。同时，本研究也未发现miR-30a rs2222722与SNAI1 rs1543442的多态性之间存在协同作用，miR-30a与SNAI1对足细胞EMT的影响的作用机制仍需进一步探讨。

本研究还根据患者年龄、性别、糖尿病病程、BMI和HbA1c水平对各基因型与DKD的相关性进行了分层分析。结果表明，rs2222722 CC基因型与DKD呈正相关，且在年龄<65岁、男性、BMI<24 kg/m2、血糖控制不良(HbA1c≥8%)的患者中更明显。而rs1543442 GG基因型携带者与DKD呈正相关，且在男性、糖尿病病程<10年、HbA1c<8%、BMI<24 kg/m2的患者中更明显，提示miR-30a和SNAI1基因型与DKD发生的关系还与临床特征有关。

本研究也存在不足之处：(1)本研究的样本量较小，应招募更多的T2DM患者组成更大的研究队列，以提高结果的代表性；(2)尽管本研究结果显示在中国重庆汉族人群中，miR-30a rs2222722 CC基因型和SNAI1 rs1543442 GG基因型是T2DM患者发生DKD的危险因素，但仍需选择更多的基因位点来验证目标基因单核酸多态性与DKD之间的关系；(3)目前尚未有其他探讨miR-30a和SNAI1基因多态性与DKD关系的研究，本研究结果仍需在其他人群中进行验证。

总之，本研究在中国重庆人群中发现miR-30a rs2222722(C>T)CC基因型和SNAI1 rs1543442(G>A)GG基因型与T2DM患者DKD的发生发展密切相关。此外，miR-30a rs2222722 CC基因型与eGFR降低和ACR升高也有密切联系，但尚需更大样本、多中心、前瞻性研究进一步验证。