银杏总黄酮调控动脉硬化大鼠自噬相关蛋白的表达

王颖超

(青海省人民医院，青海 西宁 810016)

0 引言

自噬可以维持细胞稳态，当自噬严重会引起细胞死亡，自噬发生时，损伤的细胞成分可以被清除，进而延迟动脉粥样硬化进程，使得内皮细胞抵抗炎症分子，氧化应激等，进一步抑制细胞凋亡和坏死的产生[5-7][10-11]。银杏总黄酮是中药材银杏的主要有效成分，通过以往的相关研究表明[1-4]，银杏总黄酮在维护心血管氧化应激、清除体内自由基等作用方面具有一定作用，被誉为心脏病的维护者。有专门研究已经证实白藜芦醇通过p38通路诱导自噬的发生进而延缓动脉粥样硬化[11]，故本研究以AS大鼠模型为研究对象，以白藜芦醇为阳性药物对照来探讨银杏总黄酮对AS大鼠主动脉自噬相关基因beclin-1及LC3表达水平的影响，以阐明银杏总黄酮抗动脉粥样硬化的原理，为银杏的临床应用有着科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

雄性SD大鼠，体重160g至190g，由甘肃医学实验动物中心提供。银杏总黄酮由上海源叶生物公司提供，总黄酮度56.2%；白藜芦醇由上海基兔实业公司提供，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、丙二醛试剂盒由维百瑞生物公司提供；beclin-1及LC3的 Elisa试剂盒等购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 构建动物模型

采用SD大鼠60只。随机分为6组：正常对照组(CON)、模型对照组(AS)、白藜芦醇组(Res)、银杏总黄酮低、中、高剂量组(YXZ-L、YXZ-M、YXZ-H)。CON组给予注射生理盐水，其余组按照30mg/kg标准量腹腔注射维生素D3，以及高脂饲料喂食。CON组和AS组则采用等体积生理盐水灌胃，同时给予银杏总黄酮按照125、250、500 mg/kg 的剂量灌胃，白藜芦醇组则以150mg/kg灌胃。

1.2.2 主动脉HE染色

SD大鼠处死后，固定采用4%福尔马林液，脱水及包埋切片，使用HE染色后观察大鼠内皮损失状况。

1.2.3 氧化指标测定

详细遵照试剂盒说明书方法，测定血浆中SOD、GSH-Px 活性和CAT、MDA活性变化。

1.2.4 主动脉beclin-1及微管相关蛋白LC3表达测定

取主动脉，按照elisa试剂盒说明书方法测定蛋白相对表达量。

1.2.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠动脉粥样硬化时血管内皮损伤改变

由HE染色结果可知：CON组血管内皮无损失，表面无炎性细胞且无脂质沉积，未见管腔狭窄；模型对照组内皮细胞脱落，内弹力膜消失或损坏，血管管腔增厚，泡沫细胞形成，脂质沉积严重，血管结构已经欠完整；银杏总黄酮低剂量和银杏总黄酮中剂量组主动脉内皮无明显损伤，仅见血管腔轻微增厚，轻微炎性细胞浸润，轻微脂质沉积，泡沫细胞罕见；银杏总黄酮高剂量组和白藜芦醇组血管内膜有所轻微增厚，内皮细胞水肿不明显，仅见少量内皮层撕裂，脂质沉积较少，没有发现泡沫细胞(见图1)。

图1 AS大鼠主动脉病理切片[HE染色、(400)]，A为正常对照组，B为模型对照组，C为银杏总黄酮低剂量组，D为银杏总黄酮中剂量组，E为银杏总黄酮高剂量组，F为白藜芦醇组；图片箭头所指为血管内膜

2.2 氧化应激的差异

CON组比AS组GSH-Px、SOD、CAT的表达活性均显著下降(P<0. 01)，MDA表达含量显著提升(P<0. 01)；与AS组比较，YXZ-L组MDA表达含量下降(P<0. 05)，YXZ-M组SOD、GSH-Px 表达活性提升(P<0. 05)，MDA 含量下降(P<0. 05)，YXZ-H组和白藜芦醇组GSH-Px、SOD、CAT 表达量均提升(P<0. 01)，MDA表达含量下降(P<0. 01)；证明银杏总黄酮和白藜芦醇都延缓动脉粥样硬化，机制是降低AS大鼠血清中MDA的含量，提升AS大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT的表达(见表1)。

表1 银杏总黄酮对AS大鼠GSH-Px、SOD、CAT 和 MDA等因子表达的影响(±s)

表1 银杏总黄酮对AS大鼠GSH-Px、SOD、CAT 和 MDA等因子表达的影响(±s)

注：*与正常对照组相比较，P<0.01；**：与粥样硬化组相比较，P<0.05。

Group n SOD(U/mL) GSH-Px(U/mL) CAT(U/g) MDA(µmol/L)Control 10 71.13±10.39 81.28±21.39 212.95±31.86 6.72 ±1.84 Model 10 51.53±10.16* 33.52±10.29* 112.28±21.64* 11.18±3.46*Res YXZ-L 10 10 73.11±745**56.52±7.84**53.16±11.31**43.59±10.38**152.98±24.75**131.64±24.64**8.19 ±2.14**9.21±2.16**YXZ-M 10 70.53±11.7** 44.78±12.35** 131.52±24.92** 7.49±3.94**YXZ -H 10 74.35±11.6** 59.76±11.21** 161.27±31.13** 9.45±1.14**

2.3 beclin-1及LC3蛋白表达

正常对照组beclin-1与 LC3蛋白的表达极低，而模型对照组beclin-1与 LC3蛋白表达有所升高，但并不明显(P<0.01)；银杏总黄酮组和白藜芦醇组自噬程度均高于正常对照组，并较模型组表达也明显升高(P<0.01)。提示银杏总黄酮延缓动脉粥样硬化机制是上调AS大鼠beclin-1与 LC3蛋白的表达(见图2)。

图2 ELISA检测AS大鼠主动脉beclin-1与 LC3蛋白的表达

3 讨论

60天后切片主动脉验证了大鼠粥样硬化动物模型成功，且检测血清中氧化应激指标发现AS组比CON组GSH-Px、SOD、CAT表达含量均明显下降，MDA 含量升高，说明动脉粥样硬化时大鼠抗氧化能力下降，双重证实该动物模型复制成功[4]。银杏总黄酮最重要的活性成分为总黄酮和萜内酯，有显著的扩张血管、抗氧化能力，能延缓衰老、保护心血管系统、清除体内自由基[1-4]。程嘉艺[1]等研究证实银杏总黄酮降低Caspase-3表达从而对抗内皮细胞凋亡。苑博等[9]研究发现银杏总黄酮抑制NF-kapaB通路进而发挥抗氧化作用。本研究发现，银杏总黄酮可以明显降低LC3和beclin-1表达，抑制自噬的过度表达从而延缓动脉粥样硬化的发生。

自噬是一种在细胞溶酶体中发生的消化蛋白质和细胞器活性的相对一个保守的机制，正常水平的自噬可自动修复机体损伤，过度的自噬过程会加速组织细胞凋亡[7][11]。既往研究验证，自噬与心血管疾病有关。在急性缺血再灌注、扩张性心肌病、高血压心脏病以及衰老心肌中均发现了自噬的存在，自噬在动脉粥样硬化中发挥关键的作用[11]。巨噬细胞的自噬减少了泡沫细胞的积聚，抑制了斑块形成。巨噬细胞的自噬减少斑块中炎症，稳定斑块，平滑肌细胞的自噬会加速纤维帽向变薄的方向发展，使斑块不稳定[5-6][10-12]。Martinet等[7]认为，氧自由基引起beclin-1的高表达后，抗氧化可显著降低beclin-1，这说明，活性氧是通过调节beclin-1的表达调节动脉粥样硬化细胞自噬[12]。Verheye等[5-7]发现动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞均存在自噬现象。

Beclin-1是公认的的在动物身上发现的自噬基因，在溶酶体自噬降解途径中起肿瘤抑制作用，对自噬体形成很重要[7-8]；LC3是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8的同源物，LC3 的表达与自噬泡的多少成正相关，因此，LC3 被认为是自噬体的标志分子，作为检测机体自噬程度，研究发现，ox-LDL能够诱导血管内皮细胞自噬，导致LC3和Beclin-1表达增加，在大剂量胆固醇存在下，LC3蛋白含量升高，自噬泡聚集，自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤明显抑制由胆固醇负荷诱导的自噬发生[13-14]。既往证实白藜芦醇通过p38通路诱导自噬的发生进而保护粥样硬化[11]，本研究以白藜芦醇为阳性药物对照，结果表明银杏总黄酮均能上调自噬相关基因beclin-1蛋白和 LC3蛋白表达，产生抗氧化作用，从而减少内皮细胞粥样斑块或细胞浸润，阻止氧化应激预防动脉粥样硬化，自噬在动脉粥样硬化中的作用将有可能为动脉粥样硬化的防治提供新的治疗靶点，但银杏总黄酮如何通过自噬抑制机体氧化的详细机制有待进一步探讨。