circ_0081664通过靶向miR-1205调控非小细胞肺癌细胞的生长和转移

肖雪飞 赵四林 王伟 符艳

非小细胞肺癌具有高转移潜力，导致临床预后不良，近年来，非小细胞肺癌的治疗取得了重要进展，但在转移性疾病其总体治愈率和生存率仍然很低[1-2]。研究表明circRNA与非小细胞肺癌的发生、发展和转移具有密切关系，有望成为一种理想的生物标志物，用于非小细胞肺癌的早期诊断，并提供新的治疗靶点和预后监测点[3]。研究报道circ_0081664在肺癌顺铂耐药细胞株中，显著上调[4]。然而circ_0081664对非小细胞肺癌细胞的生长和转移的影响及机制尚不清楚。研究报道miR-1205在非小细胞肺癌中起肿瘤抑制作用，可以抑制裸鼠中A549移植瘤的生长[5]。miR-1205在人喉鳞状细胞癌组织中被下调，miR-1205过表达减弱了人喉鳞状细胞癌细胞的迁移，生长和侵袭[6]。因此，本实验旨在研究circ_0081664对非小细胞肺癌细胞的生长和转移的影响及其机制，是否与miR-1205有关。

资料与方法

一、组织材料

选取2016年1月至2020年5月期间本院收治的30例非小细胞肺癌患者，通过手术取其癌组织及相应的癌旁组织，取出标本后立即置于液氮中，而后置于-80℃冰箱中保存；入选患者未经过放化疗，所有患者均知情且同意。

二、主要试剂

A549细胞(货号：HZ-H122，上海沪震实业有限公司)；RPMI-1640培养基(货号：GNM-31800，上海经科化学科技有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(货号：218073，上海研卉生物科技有限公司)；MTT试剂盒(货号：GOY-9134，上海谷研实业有限公司)；凋亡检测试剂盒(货号：FXP018，北京四正柏生物科技有限公司)；Transwell小室、Matrigel(货号：354483、354277，美国Corning公司)；RIPA蛋白裂解液(货号：00000190，上海北诺生物科技有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：12535，上海宇劲生物技术有限公司)。si-NC、si-circ_0081664、pcDNA-NC、pcDNA-circ_0081664、miR-NC、miR-1205(百奥迈科生物技术有限公司)。Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9、P21、Bax抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司)。

三、细胞分组

A549细胞用RPMI-1640培养基常规培养，将si-NC、si-circ_0081664、pcDNA-NC、pcDNA-circ_0081664、miR-NC、miR-1205分别转染至A549细胞中，记为si-NC组、si-circ_0081664组、pcDNA-NC组、pcDNA-circ_0081664组、miR-NC组、miR-1205组；将si-circ_0081664分别与anti-miR-NC、anti-miR-1205共转染至A549细胞中，记为si-circ_0081664+anti-miR-NC组、si-circ_0081664+anti-miR-1205组。

四、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0081664和miR-1205的表达水平

取适量组织及各组细胞，提取其总RNA，合成cDNA后进行荧光定量PCR，反应条件为95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；circ_0081664和miR-1205分别以GAPDH和U6为内参，用2-△△Ct法计算其相对表达量。circ_0081664上游引物序列：5′-AGTCTGGACCTGTCAGGATTG-3′，下游引物序列：5′-ACTGGCACAAGGCAGTAACA-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-1205上游引物序列：5′-CCCTCTGCAGGGTTTGCTTTGAG-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

五、 MTT实验

在各组细胞培养至24 h时，每孔分别加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培养箱中继续孵育4 h后弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(OD490 nm)值。

六、流式细胞术检测细胞凋亡

取转染24 h后生长状态良好的细胞，吸弃上清液，PBS漂洗细胞2次，加入结合缓冲液重悬，分别加Annexin V-FITC和PI各5 μL，轻摇混匀，再加入结合缓冲液350 μL，混匀，常温避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

七、Transwell小室实验

迁移实验：将细胞用无血清培养基以5×105细胞/mL的密度悬浮，将100 μL悬浮液添加到Transwell小室上室，在培养箱培养48 h，用棉签除去膜顶表面上未迁移的细胞；然后用甲醇固定30 min，PBS洗涤细胞后再用1%的结晶紫染色30 min，用PBS轻轻清洗两次，风干后用倒置显微镜拍摄并计数细胞。侵袭实验用Matrigel覆盖Transwell小室上室，其余步骤与迁移实验相同。

八、Western blot实验

提取细胞总蛋白，通过电泳分离蛋白，转至聚偏二氟乙烯膜，封闭液封闭后加入Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9、P21、Bax一抗(1 ∶800)，4℃孵育过夜，加入二抗(1 ∶1200)室温孵育2 h，用ECL发光液显影，成像后检测蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参，蛋白相对表达水平为目的条带和β-actin条带灰度值的比值。

九、双荧光素酶报告实验

使用在线软件Starbase预测circ_0081664和miR-1205的靶向结合位点。使用PCR扩增，包含miR-1205结合位点的circ_0081664序列片段(上游引物：5′-AAAGTCGACACTTCCTGCAGT-3′，下游引物5′-CCCGTCGACACTGGCACAAGGCAGTAACA-3′)，并构建至pmir-GLO luciferase载体中，获得circ_0081664野生型载体(WT-circ_0081664)，将circ_0081664序列 UGCAAAAG突变为GUACCG，获得circ_0081664突变型载体(MUT-circ_0081664)，将WT-circ_0081664、MUT-circ_0081664分别与miR-NC、miR-1205共转染至A549细胞中，转染48 h后，检测荧光素酶活性。

十、统计学分析

结 果

一、 circ_0081664和miR-1205在组织中的表达

与癌旁组织比较，肺癌组织中circ_0081664表达水平升高，miR-1205表达水平降低(P<0.05)(见表1)。

表1 circ_0081664和miR-1205在组织中的表达

二、抑制circ_0081664表达对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

与si-NC组比较，si-circ_0081664组A549细胞活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表达水平降低，P21、Bax表达水平升高，细胞凋亡率升高，迁移侵袭细胞数减少(P<0.05)(见表2，图1、2)。

图1 抑制circ_0081664表达对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭相关蛋白表达的影响A：增殖相关蛋白表达；B:凋亡相关蛋白表达；C：迁移、侵袭相关蛋白表达

图2 抑制circ_0081664表达对A549细胞凋亡及迁移侵袭的影响A：凋亡图；B:迁移、侵袭图(结晶紫染色, ×200)

表2 抑制circ_0081664表达对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

三、 circ_0081664靶向调控miR-1205的表达

Starbase预测显示circ_0081664的序列中含有与miR-1205互补的核苷酸序列(图3)。WT-circ_0081664与miR-1205共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，MUT-circ_0081664与miR-1205共转染后细胞荧光素酶活性无显著变化(见表3)。与pcDNA-NC组比较，pcDNA-circ_0081664组miR-1205表达水平降低；与si-NC组比较，si-circ_0081664组miR-1205表达水平升高(P<0.05)(见表4)。

表3 双荧光素酶报告实验

图3 circ_0081664的序列中含有与miR-1205互补的核苷酸序列

表4 circ_0081664靶向调控miR-1205的表达

四、过表达miR-1205对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

与miR-NC组比较，miR-1205组A549细胞活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表达水平降低，P21、Bax表达水平升高，细胞凋亡率升高，迁移侵袭细胞数减少(P<0.05)(见表5，图4-5)。

表5 过表达miR-1205对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

五、干扰miR-1205表达逆转抑制circ_0081664表达对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

与si-circ_0081664+anti-miR-NC组比较，si-circ_0081664+anti-miR-1205组A549细胞活性升高，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表达水平升高，P21、Bax表达水平降低，细胞凋亡率降低，迁移侵袭细胞数增加(P<0.05)(见表6，图6、7)。

表6 干扰miR-1205表达逆转抑制circ_0081664表达对A549细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

讨 论

非小细胞肺癌是肺癌的主要发病类型，随着分子靶向药物治疗进展，使得非小细胞肺癌的治疗方案更加个体化，精确化[7-8]。circRNA在肺癌的发生，转移和预后中起关键作用，可以作为潜在的肿瘤诊断和预后的生物标志物[9]。研究报道circPTK2过表达抑制非小细胞肺癌细胞上皮-间质转化和转移[10]。抑制circRNA 100146可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡[11]。敲除circZFR可以显著抑制体外培养的非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和侵袭[12]。circ_0081664来源于LRWD1的一种环状RNA，位于chr7:102107785-102109101；已有研究表明circ_0081664在肺癌顺铂耐药细胞株中显著上调[4]。本实验结果显示，肺癌组织中circ_0081664表达水平升高，提示circ_0081664可能在肺癌中起促癌作用；转染circ_0081664抑制表达载体后，A549细胞的活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表达水平降低，P21、Bax表达水平升高，细胞凋亡率升高，迁移侵袭细胞数减少；表明抑制circ_0081664表达可抑制A549细胞增殖、迁移侵袭，且促进细胞凋亡。

miR-1205是一种miRNA，位于chr8:(127960633-127960695)，研究表明miR-1205可促进肺腺癌及前列腺癌细胞生长[13-14]。本实验结果显示，肺癌组织中miR-1205表达水平降低，提示miR-1205可能在肺癌中起抑癌作用。miR-1205过表达后A549细胞活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表达水平降低，P21、Bax表达水平升高，细胞凋亡率升高，迁移侵袭细胞数减少；表明miR-1205过表达可抑制A549细胞增殖、迁移侵袭，且促进细胞凋亡。此外，研究报道circRNA可通过调控miRNA影响肿瘤的进展，如circ_0039411通过miR-1205 / MTA1通路促进甲状腺乳头状癌细胞的生长，迁移和侵袭[15]。circ_0034642通过调节miR-1205/S100A8轴促进胶质瘤细胞增殖，迁移和侵袭能力并抑制细胞凋亡[16]。circ_0002052过表达，通过调节miR-1205/APC2轴显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，同时促进了细胞凋亡[17]。此外，本实验还发现circ_0081664靶向调控miR-1205，同时抑制circ_0081664和miR-1205表达后，细胞活性升高，细胞凋亡率降低，迁移侵袭细胞数增加；表明miR-1205可影响circ_0081664对肺癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响。

综上所述，抑制circ_0081664表达可能通过上调miR-1205抑制非小细胞肺癌细胞的生长和转移。