去整合素金属蛋白酶15通过AKT/ERK通路和MMP9影响肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

周洁琦 徐圣杰 高莉蓉 刘泽毅

肺癌是导致癌症相关性死亡的主要原因[1]，肺癌的发病率和死亡率均位于全球首位[2]。尽管有针对非小细胞肺癌(NSCLC)的多种治疗方法，对于晚期患者疗效仍然有限，五年生存率仍然较低[3]。因此，迫切需进一步研究NSCLC的发病机理，并寻找有效的治疗方法。去整合素金属蛋白酶(ADAM)属于去整合素金属蛋白酶家族成员，包括信号肽，前肽，金属蛋白酶域，去整合素域等区域，在调节细胞与细胞和细胞与基质的相互作用中起到重要作用[4-5]。研究表明ADAM15在许多实体恶性肿瘤中表达上调，且ADAM15的高表达与肿瘤的发生和转移有关，提示ADAM15高表达的患者预后较差[4, 6]。因此，本研究旨在探讨ADAM15对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能的机制，旨在为肺癌的治疗提供新的靶点。

资料与方法

一、组织样本

收集2016至2018年苏州大学附属第一医院呼吸与危重症医学科20对肺癌组织及相应的癌旁组织样本。所有患者术前均未经放化疗和介入等治疗。此研究经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准[2016伦理(申报)批第157-1号], 并获得所有涉及此研究患者的知情同意。

二、实验试剂

Trizol、RT-PCR试剂盒及SYBR Green RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；ADAM15引物(苏州金唯智科技有限公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(赛默飞公司)；ADAM15干扰序列(苏州吉玛基因股份有限公司)；Cell counting kit-8(CCK8)试剂(碧云天公司)；RPMI-1640培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；结晶紫染液(上海生工公司)；ADAM15抗体(Santa Cruz公司)、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、MMP2、MMP9抗体(CST公司)；β-actin抗体、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康为世纪生物科技有限公司)。

三、细胞培养

人肺癌细胞系A549、H1299、SPC、H460及人正常肺上皮细胞BEAS-2B均从上海中国科学院细胞库购买。细胞均在含有10%FBS和1%双抗(100U/ml青霉素和链霉素)的RPMI-1640的完全培养基中，37 ℃、5%CO2条件下恒温培养。

四、瞬时转染

将H460细胞接种在六孔板中，当细胞密度达到40%～60%时，我们按照制转染试剂盒说明书使用Lipofectamine 2000进行转染。48～72 h后，收集细胞用于进一步实验。AMAM15的干扰序列如下：ADAM15-1 siRNA：5′-CCCAGC UGUCACCCUCGAA-TT-3′; ADAM15-2 siRNA：5′-GAUCUACUCUGGGAGA CAATT-3′。

五、实时荧光定量PCR

严格按照Trizol试剂说明提取细胞总RNA，并进行反转录及RT-PCR检测。ADAM15上游引物：AGCCTCAAAAAGGTGCTTCA，下游引物：TGGTAGCA GCAGTTCTC；β-actin的上游引物：CACAGAGCCTCGCCTT TGCC，下游引物：ACCCATGCCCACCATCAC。

六、CCK8细胞增殖实验

根据CCK8试剂说明书，使用CCK-8试剂检测细胞的增殖能力。将H460细胞以每孔3×103个细胞的密度接种在96孔板中，每孔设计3个复孔，分别在铺板后24、48、72 h加入10ul CCK8试剂，继续放到培养箱中培养2h，然后用酶标仪测定细胞在450nm和630nm的光密度值(OD值)。

七、划痕实验

将H460细胞接种在6孔板中，转染48 h，待细胞密度达到90%后，使用10 μl移液器吸头以及无菌标尺轻轻、缓慢地在水平线划一条划痕，垂直线划三条划痕。用PBS洗后换无血清培养基后继续培养48h。在显微镜下分别在0h和48h取同样的位置进行拍照。

八、小室(Transwell)检测迁移和侵袭

将H460细胞接种在6孔板中，转染48 h，待细胞密度达到90%。消化细胞进行计数，然后用含1% FBS的培养基重悬。向基质胶包被的小室上室加入200 ul含12×104细胞的细胞悬液，向基质胶未包被的小室上室加入200ul含8 ×104细胞悬液，下室均加入800ul完全培养基。培养24h，取出小室，PBS洗涤后甲醇固定30min，再用结晶紫染色2h，用棉棒轻轻擦去上室面细胞，于显微镜下观察拍照并计数。

九、蛋白质印记(Western blot)检测蛋白

转染H460细胞系后使用RIPA法提取细胞总蛋白并制作蛋白样品。以每孔50ug蛋白样品加样，用湿转法将蛋白转至NC膜上，一抗4°过夜孵育，TBST洗4次/5 min，二抗室温孵育2 h，TBST洗4次/5 min，显影检测蛋白表达。

十、统计学分析

结 果

一、OSluca网站预测各数据库中ADAM15与肺癌的预后的关系

通过Osluca网站(http://bioinfo.henu.edu.cn/LUCA/LUCAList.jsp)中的多个数据库分析了ADAM15对肺癌预后的影响，结果显示在大多数数据库中风险比(HR)大于1，表明ADAM15可能与肺癌的预后不良有关(图1)(P<0.05)。

图1 OSluca预测各数据库中ADAM15与肺癌预后的关系

二、ADAM15在肺癌细胞株和肺癌组织中呈高表达

通过Western blot的检测，ADAM15在正常肺上皮细胞株BEAS-2B和肺癌细胞株A549、H1299、SPC、H460中相对表达水平(图2A)，定量如(图2B)。由于ADAM15在H460细胞株中表达较高，故选择H460细胞株进行后续实验。使用实时定量PCR在肺癌组织和相应的癌旁组织中也检测ADAM15的表达，在20对肺癌组织和相应的癌旁组织中，ADAM15在13对肺癌组织中呈高表达，占比65%(图3)(t=2.226，P=0.038)。

图2 ADAM15在肺癌细胞株中呈高表达注：A:Western blot检测了ADAM15在人支气管上皮细胞BEAS-2B，以及肺癌细胞A549, H1299, SPC和H460中表达水平(n=3, 每个实验独立重复3次); B：为左图的蛋白定量图(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)

图3 实时荧光定量PCR检测了ADAM15在肺癌组织和相应的癌旁组织的中的表达水平(n=20,*P<0.05)

三、ADAM15影响H460细胞的增殖，迁移和侵袭

图4 CCK8实验反应了H460细胞干扰ADAM15后各组间的细胞增殖能力(n=3, 每个实验独立重复3次，***P<0.001)

图5 划痕实验反映了H460细胞干扰ADAM15后各组间的细胞迁移能力(×40)(n=3, 每个实验独立重复3次)

四、ADAM15对相关信号通路的影响

在H460细胞中干扰ADAM15后，检测增殖和转移有关的相关蛋白的变化，结果表明，磷酸化的AKT和ERK的表达随着ADAM15的干扰显著下降，但总的AKT和ERK的表达并没有显著变化。随着ADAM15的干扰，基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达也显著下降，然而，基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达并没有明显变化(图7A)，定量如(图7B)，具体参数(见表1)。

图7 ADAM15对相关信号通路的影响注：A: Western blot检测了H460细胞干扰ADAM15后各组间ADAM15和下游蛋白的表达水平，β-actin作为内参(n=3, 每个实验独立重复3次); B:为左图的蛋白定量图(**P<0.01; ***P<0.001)

表1 H460细胞增殖和转移相关的蛋白相对定量

讨 论

据报道，ADAM15在许多恶性肿瘤中表达上调，且ADAM15的高表达与肿瘤的发展和转移有关[6-7]。然而，在某些癌症中，例如结肠癌，ADAM15表达的降低与结肠癌患者的癌症转移和预后不良有关[8]，因此，我们认为ADAM15在各种类型的癌症中起着不同的作用。在我们的研究中，我们发现ADAM15在肺癌组织中的表达高于癌旁组织，并且我们通过大数据分析观察到ADAM15的高表达与肺癌患者的不良预后相关。

ADAM15是一种位于细胞膜上的金属蛋白酶，它是唯一在其去整合素结构域中具有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)位点的ADAM家族成员，它可以通过与整合素αVβ3，α5β1结合而在细胞粘附中发挥作用[5, 9-10]，因此，ADAM15是否可以通过整合素介导的信号通路进而在肺癌的发生发展中发挥作用值得进一步探讨。

磷酸肌醇3激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，作为多种重要基因，如表皮生长因子受体(EGFR)的下游通路，已经被证明对肺癌的增殖具有重要作用[11-13]。MMP2和MMP9属于MMP家族的成员可以降解胶原蛋白和凝胶，和肿瘤的转移和侵袭有关[14-17]。欧小波等人证明ADAM15可以通过影响MMP9促进乳腺癌侵袭，并将两者联合作为评估乳腺癌恶行生物学行为的指标[18]。本研究证明ADAM15通过调控PI3K-AKT和MAPK-ERK信号通路影响H460细胞的增殖，并且ADAM15被干扰后，MMP9的表达随之减少，而MMP2的表达无明显变化，表明ADAM15可能通过调控MMP9通路影响H460细胞的迁移和侵袭。

综上所述，ADAM15的下调可以抑制H460细胞的增殖、迁移和侵袭，这将为肺癌的治疗提供新的线索。