哮喘患者外周血NPRA、GATA3表达与患者免疫功能失调及病情程度的关系

袁启奎 曾荣

哮喘属于呼吸道常见的慢性疾病，一般气道炎症反应是哮喘发作的主要临床表现，具体发病机制已经公认的主要是Th2型应答优势化介导气道炎症导致，严重的影响了患者生活质量与身心健康[1]。有报道称GATA结合蛋白3为Th细胞分化特异性转录因子，是影响Th细胞分化与功能表达重要因子；心房利钠肽则已经证实能够介导免疫调节，而外周血利钠肽受体A，则人体的肺脏分布广泛，同时基因多态性研究发现同哮喘易感性关系密切[2]。本研究对哮喘患者体内NPRA、GATA 3mRNA的表达同病变程度之间联系进行分析，目的是为哮喘早期诊断，评估病情严重性提供依据，现报告如下。

材料与方法

一、资料

选取武汉市武昌医院收治的哮喘患者156例(哮喘组，其中急性发作期84例、稳定期72例)、正常体检志愿者60例作为对照组，患者纳入时间范围2018年6月～2020年1月。纳入标准：(1)哮喘的诊断标准参考中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的诊断标准[3]；(2)年龄范围19～65岁；(3)对照组为体检志愿者；(4)本研究与医学伦理要求无违背之处(伦理学文件编号：院伦(办)[2016]19号)。排除标准：(1)慢性阻塞性肺疾病患者；(2)支气管扩张、肺癌、肺结核、肺部感染；(3)经3个月内使用糖皮质激素、免疫抑制剂的患者；(4)变应性鼻炎、类风湿性关节炎、荨麻疹等免疫系统疾病。

二、RT-PCR法

采用逆转录聚合酶链反应对NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达测定。清晨空腹抽取肘静脉血液6mL加入淋巴细胞分离液，分离出来细胞沉淀吹打混匀在QIAzol Lysis Reagent，置于-80℃冰箱备用，提取总RNA并进行定量，RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，采取紫外分光光度计进行反转录定量。引物为上海生工生物工程公司合成。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环后进行mRNA检测，电泳结束后将图像输凝胶成像系统，对各条带灰度值进行分析。

三、流式细胞仪技术

检测两组研究对象的检测两组研究对象外周血调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、Th2细胞水平。

清晨空腹抽取1 mL静脉血，仪器采用美国BD公司的流式细胞仪器，取100μl全血加入刺激剂，4℃避光孵育30min，直接加入1mL氯化铵红细胞裂解10min，缓冲液冲洗3次后12000 r/min，离心时间5min，将10μlAPC标记鼠抗人Foxp3单克隆抗体加进洗涤缓冲液，4℃避光孵育30min，直接加入300μL流式细胞染色缓冲液，重悬后进行Treg检测。

100μL全血加入刺激剂10μl培养4～6h加入10μlCD3-PC5、10μL CD8-PC7避光孵育15min，室温条件下避光孵育15min；缓冲液冲洗后以12000r/min离心5min，加入10μL IFN-γ-FITC、IL-4-PE，室温条件下避光孵育15min，细胞重悬后检测Th1细胞、Th2细胞水平。

四、ELISA法

抽取空腹清晨静脉血3 mL，2000 r/min离心，30min后采用ELISA测定IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ浓度，试剂盒为武汉华美生物工程有限公司提供。

五、统计学处理

结 果

一、一般资料对比

对照组与哮喘组急性发作期患者、稳定期患者的基线资料进行分析，具有较好的均衡性(P>0.05)(表1)。

表1 一般资料对比

二、三组研究对象的NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达强度比较

NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达水平比较，对照组低于哮喘组急性发作期患者、稳定期患者且差异显著(P<0.05)；NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达水平比较，稳定期哮喘患者低于哮喘组急性发作期患者且差异显著(P<0.05)(表2、图1、图2)。

表2 NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达强度组间比较

图1 NPRA mRNA电泳图。(M为maker，1为对照组、2为稳定期患者、3分急性期患者的β-actin，4为对照组、5为稳定期患者、6为急性期患者的急性期组NPRA mRNA电泳条带)

图2 GATA 3 mRNA电泳图。(M为maker，1为对照组、3为稳定期患者、5分急性期患者的β-actin条带，2为对照组、4稳定期患者、6为急性期分别为对照组、组、组GATA 3 mRNA条带)

三、三组研究对象的Treg细胞、Th1细胞、Th2细胞水平比较

对照组外周血的Treg细胞、Th1细胞、Th2细胞水平高于哮喘组急性发作期患者、稳定期患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；稳定期哮喘患者的Treg细胞、Th1细胞、Th2细胞水平高于哮喘组急性发作期患者，差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 外周血免疫细胞检测结果

四、三组研究对象的免疫细胞因子水平比较

IL-2、IFN-γ水平组间分析，对照组的高于哮喘组急性发作期患者、稳定期患者且差异具有显著性(P<0.05)；IL-6、TNF-α水平组间比较，对照组低于哮喘组急性发作期患者、稳定期患者且差异显著(P<0.05)；IL-2、IFN-γ水平在稳定期与急性发作期患者之间比较，稳定期高于哮喘组急性发作期(P<0.05)；稳定期哮喘患者的IL-6、TNF-α水平低于哮喘组急性发作期患者，差异具有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 三组研究对象的免疫细胞因子水平比较

五、哮喘急性期患者NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达与细胞因子的关系

对84例急性发作期哮喘患者进行分析，NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达与IL-2、IFN-γ水平呈显著负相关性(P<0.05)；NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达与IL-6呈正相关性(P<0.05)(表5)。

表5 相关性分析结果

讨 论

哮喘属于呼吸系统高发疾病，有报道称世界范围内罹患哮喘近3亿人，主要临床症状是气道炎症反应与气道高反应，最终造成呼吸系统阻力增加，导致了通气血流比例失衡，严重的形成代谢性酸中毒甚至呼吸衰竭，危及患者生命安全[3]。有报道指出在哮喘发作过程中，缺氧会造成血管内膜增厚，细胞内皮功能丧失，免疫力降低后导致体内形成恶性循环，病情不断加重[4-5]。目前对于哮喘评估的方式较多，传统的纤维支气管镜最为常用，但是会对患者气道黏膜造成损伤，部分患者无法接受，气道反应性检测、呼出气冷凝等方式则检测的敏感性与特异性不高，而且操作相对复发，因此无法大范围推广应用[6-7]。

本研究发现对照组的外周血的Treg细胞、Th1细胞、Th2细胞水平最高，其次为稳定期哮喘患者，而急性发作期哮喘患者上述因子水平最低，表明在哮喘患者体内存在免疫功能紊乱，而且急性期患者体内免疫紊乱更严重，患者炎症反应更为严重[8]。正常状态下人体Th1和Th2亚群处于平衡状态，发挥免疫作用，对细胞亚群功能进行调节，让人体免疫功能处于正常，在致病因素诱导下体内Th1和Th2失衡导致免疫应答过程被影响，导致哮喘发作[9]。IFN-γ属于气道炎症介质，可以调节免疫活性，哮喘发作会导致气道上皮细胞脱落，Th1细胞则分泌IL-2、IFN-γ促进细胞免疫应答，可以抑制哮喘发生，发展；TNF-α则是活化巨噬细胞形成，能够增加局部炎症反应程度，严重的会导致器官损伤；IL-6则是具有生物学活性的细胞因子，对免疫应答、促进B细胞的增殖与分化具有重要意义，上述炎症细胞因子均参与了哮喘的发生和发展[10-11]。

但是上述指标在对哮喘发生发展的进程灵敏性与特异性一般，本研究对哮喘患者外周血利钠肽受体A(NPRA)、GATA结合蛋白3(GATA 3)mRNA的表达与患者免疫功能变化及病情严重程度的相关性进行了创新性探讨。哮喘发病的重要机制是Th2应答优势化介导持续的过敏性炎症反应，心房钠尿肽可以介导免疫调节，对Th17细胞分化具有调控作用，利钠肽受体A则在人体的肺部广泛分布，其激活后下有信号可以促进转录因子表达并介导细胞生长、增殖和炎症反应，因此在介导Th2应答优势进而加重哮喘发展具有重要的意义[12]。GATA3作为转录因子在正常组织中对于细胞生长具有调节作用，同时还能够促进细胞分化，作为转录因子可以对多中心遗传分化方向进行干预，因此是导管上皮细胞分化的关键因子[13]。动物学试验发现在哮喘小鼠进开展外源性心房钠尿肽干预，小鼠气道局部组织的白细胞介素4表达升高，肺组织GATA3表达同样增多，而阻断心房钠尿肽信号则消失，这也进一步证实了心房钠尿肽信号通过白细胞介素4、GATA3优势化表达促进了哮喘的发作[14-15]。

本研究显示对照组的NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达水平低于哮喘组急性发作期患者、稳定期患者，而稳定期哮喘患者的NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达水平低于哮喘组急性发作期患者，提示在哮喘患者体内存在NPRA mRNA、GATA 3 mRNA水平降低，而且急性期患者表达水平更低。通过相关性分析发现，NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达与IL-2、IFN-γ水平呈显著负相关性；NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达与IL-6呈正相关性，提示了NPRA mRNA、GATA 3 mRNA同哮喘发作和炎症反应程度具有一定的关联性。本研究对患者体内炎症水平与免疫紊乱之间的关系进行相关性分析，也对哮喘患者进行了分层研究，这在以往分析中相对少见，但是由于入组患者病例少，而且未能进行动态分析，还需要进一步扩展样本量，开展系统全面深入研究，为临床哮喘治疗个体化方案制定，提供依据。

综上述所，哮喘患者外周血中NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表达上调，可能与外周血T细胞介导的免疫细胞因子失衡有关。