cf-DNA联合CD11b对HIV阴性肺孢子菌肺炎患者预后评估的价值

张环 陶小根

肺孢子菌肺炎(pneumocystis jirovecii pneumonia，PCP)是HIV感染者常见的机会性感染。近年来由于器官移植技术的发展、恶性肿瘤患者的不断增多以及糖皮质激素/免疫抑制剂的广泛应用，PCP在免疫功能低下的HIV阴性患者中的发病率逐渐上升[1]。部分HIV阴性PCP可迅速进展为重症肺炎，引起不可逆的呼吸衰竭，病死率可达26%～64%[2]。中性粒细胞是机体先天免疫的重要成分，其表面黏附分子CD11b与CD62L是中性粒细胞活化的标志物，介导中性粒细胞与内皮细胞的黏附，促使中性粒细胞向炎症处聚集。NETs是中性粒细胞在各种刺激下活化，细胞核内DNA及抗菌颗粒蛋白等物质释放到胞外所形成的网状结构[3]。NETs可通过杀灭病原体而发挥其生物学效应，但过度释放可加重炎症反应导致周围组织损伤。本研究旨在探讨NETs水平、中性粒细胞表面黏附分子CD11b、CD62L表达以及APACHE Ⅱ评分对HIV阴性PCP患者预后的预测价值。

资料与方法

一、一般资料

选取2018年6月至2020年12月间在中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)住院的60例HIV阴性PCP患者，诊断依据2016年第五届欧洲白血病感染会议(ECIL)制定的血液病/恶性肿瘤患者和干细胞移植受者肺孢子菌肺炎诊断标准[4]：新发的呼吸道症状；胸部影像学可见新发的肺泡浸润影或弥漫性磨玻璃影；痰液或支气管肺泡灌洗液(BALF)六胺银染色发现肺孢子菌包囊和/或肺孢子菌DNA阳性。纳入标准：符合PCP诊断标准；年龄≥18周岁；HIV检测结果阴性者；临床资料完整者。排除标准：HIV/AIDS患者；合并有肺孢子菌之外其他真菌感染者；重要数据缺失者；随访缺失者；已常规用药预防者。依据ECIL指南进行规范化治疗[5]，足量应用复方磺胺甲噁唑，根据临床疗效及时联合克林霉素或卡泊芬净治疗，依据病情需要，采用机械通气或血液净化治疗。根据患者住院28d预后结局分为存活组(38例) 、死亡组( 22 例) 。本研究经医院伦理委员会批准(2020KY伦审第228号)，研究对象或家属签署知情同意书 。

二、方法

1. 血指标测定:分别于治疗前收集外周静脉血2mL，全自动血细胞分析仪(Sysmex,日本)测定检测白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数；同时收集静脉血5mL，进行离心处理后获得上清液，分别应用免疫比浊法、放射免疫学分析法测定患者C反应蛋白(CRP)及降钙素原(PCT)水平。剩余血标本用于后续指标检测。

2. 中性粒细胞表面黏附分子CD11b、CD62L检测: 采集各组外周血1mL加入EDTA抗凝管，用人中性粒细胞分离试剂盒(北京索莱宝公司)提取中性粒细胞后重悬细胞，分别加入BV421抗CD62L(美国BD公司)，BV510抗CD11b(美国Biolegend公司)流式细胞抗体0.5ul，混匀转管后行流式细胞仪检测。流式细胞术分析采用流式细胞仪软件(美国新泽西州富兰克林湖生物科学中心)。

3. cf-DNA/NETs检测: 使用PicoGreen dsDNA Quantitation Kits(美国Invitrogen公司)测定：①采集外周静脉血1mL，离心后取上清至于-20℃保存；②用TE缓冲液将PicoGreen稀释成1×染料工作液避光储存备用；③制作标准曲线：用TE工作液将100ug/mLDNA储存液稀释成2ug/mL DNA标准品工作液，按照浓度依次为1000、100、10、1、0ng/mL倍比稀释各梯度标准品溶液，将标准品溶液与PicoGreen 荧光染料工作液室温避光孵育5min后用荧光酶标仪检测各梯度标准品荧光值，根据标准品的浓度及对应的荧光值制作标准曲线；④将待测样本血清50ul与PicoGreen 荧光染料工作液100ul避光孵育5min后荧光酶标仪检测各样本荧光值；根据标准曲线计算样本cf-DNA/NETs水平。

4. 采用APACHE Ⅱ评分系统评估PCP患者病情: 入院24h内采用 APACHE Ⅱ评分评估患者病情。APACHE Ⅱ评分系统包括3个部分: 急性生理评分、慢性健康评分、年龄评分，总分71分。分值越高，对应病情越严重。

三、统计学方法

结 果

一、存活组、死亡组一般资料比较

存活组与死亡组性别、年龄、基础疾病、是否使用糖皮质激素或免疫抑制剂、住院激素使用情况、白细胞计数、CRP水平均无显著差异(P>0.05)，死亡组中性粒细胞计数、PCT水平、APACHEII评分高于存活组，淋巴细胞计数低于存活组，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 一般资料及入院24h内相关指标

二、存活组与死亡组中性粒细胞表型的表达

检测两组PCP患者外周血中性粒细胞表面CD62L和CDllb分子MFI的表达。死亡组外周血白细胞(PBNs)活化指标CD11b高于存活组，荧光强度分别为(11681.23±1882.45.vs. 9435.26±1224.01；P<0.001)，差异有统计学意义(见图1A,C)，CD62L两组之间差异无统计学意义(P>0.05)(见图1B,D)。

图1 两组PCP患者PBNs CDllb、CD62L表达的比较(***P<0.001，有统计学意义；ns：P=0.146，差异无统计学意义)

三、存活组、死亡组血浆cf-DNA/NETs水平

死亡组cf-DNA/NETs含量高于存活组，分别为(2282.50±458.38ng/mL .vs. 1497.05±466.15ng/mL；P<0.001)，差异具有统计学意义(见图2)。

四、预后相关影响因素分析

以患者预后作为因变量(赋值方法：存活=1，死亡=0)，将CD11b、cf-DNA/NET水平按四分位数间距转换为四分类变量资料，二元Logistic回归分析在相互校正单因素分析有意义的指标后，结果显示CD11b、cf-DNA、APACHE Ⅱ评分每增加一个单位，死亡风险分别增加138.5%(P=0.019)、166.7%(P=0.011)和35.6%(P=0.002)，而淋巴细胞每增加一个单位，死亡风险降低77.%(P=0.004)(见表2)。

表2 相关因素对预后的预测价值

五、相关影响因素对患者预后的效能比较

CD11b联合cf-DNA的ROC曲线下面积(area under ROC curve，AUC)大于单独使用CD11b、cf-DNA或APACHE Ⅱ评分，提示联合检测的预测价值较大，敏感度为95.5%，特异度为89.5%。(见图3、表3)。

表3 各指标对PCP患者28d预后的预测价值

图3 各指标预测PCP患者28d预后的ROC曲线

讨 论

发生在HIV阴性免疫低下人群的肺孢子菌肺炎常伴有病情重、病死率高等特点，造成了严重的社会经济负担，探寻其预后影响因素具有重要的临床意义。APACHE Ⅱ评分是临床常用于评估病情严重程度的评分方法，可通过估计病死率来预测患者预后。既往研究发现APACHE Ⅱ评分与HIV阴性PCP患者的预后密切相关[6]，在本研究中我们也得出了类似的结果，Logistic分析还提示APACHE Ⅱ评分每升高1分，患者死亡风险增加35.6%。

中性粒细胞在受到病原微生物刺激后能够通过释放NETs来杀灭病原体，但过度的NETs也可以造成周围组织的损伤，目前已被证实NETs可能参与了多种肺部疾病的发生发展过程，如重症肺炎、COVID-19、ARDS等[7-9]。Gaborit等[10]曾发现PCP患者中性粒细胞计数的升高，但未进一步报道NETs在PCP中的变化。本研究通过测定外周血cf-DNA/NETs浓度，发现HIV阴性PCP患者外周血中NETs水平显著增高，这与在其他肺部疾病中观察到的结构类似[7-9,11]。通过回归分析还发现cf-DNA/NETs与预后相关，可作为患者预后的预测因素，其灵敏度及特异度均较好。我们推测NETs的增高可能由孢子菌在肺内产生的细胞免疫反应引起中性粒细胞聚集所导致，但过度的NETs直接导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞的损伤，NETs水平越高，其损伤程度越重，死亡风险越高。

本研究通过对比患者资料发现，PCP患者淋巴细胞计数低于参考范围，且死亡组较存活组更低，与既往报道结果类似[12]，淋巴细胞作为体内主要的免疫细胞，其总数的减少也反映了机体细胞免疫功能的减退，而且初始淋巴细胞的减低是PCP患者死亡的独立危险因素[13]。当细胞免疫功能受损时，巨噬细胞及T细胞免疫缺陷，机体无法将孢子菌由肺泡内清除，巨噬细胞也无法清除过多的NETs，也可能导致NETs的异常增多。

CD11b是一种选择性表达于白细胞表面的黏附分子，能够使中性粒细胞由血管内皮细胞游出，向炎症部位聚集，被认为是中性粒细胞活化的标志[14]，也是疾病预后的不良因素[15]。本研究中，我们观察到在HIV阴性PCP患者中CD11b的表达显著增高，与在VAP患者中观察到的变化一致[16],但该试验未进一步探讨其与预后的关系，我们的研究对比了死亡组和存活组CD11b表达水平，显示死亡组CD11b表达更多。CD11b的高表达更有利于中性粒细胞的渗出、聚集[17]，从而释放更多的NETs，组织损伤进一步加重，ROC曲线提示CD11b可作为患者预后的独立预测因素。

本研究由于标本量有限，结果可能存在偏倚，而且部分病例依赖PC-DNA诊断，可能存在假阳性结果，同时我们也未对HIV阴性PCP患者体内中性粒细胞凋亡和清除标志物作进一步检测，无法了解到NETs对PCP患者的中性粒细胞凋亡的影响，相关情况仍有待后续进一步观察。

综上，APACHE Ⅱ评分、CD11b、cf-DNA/NETs对HIV阴性PCP患者预后有一定预测价值，其中CD11b+cf-DNA联合预测效能最佳。