不同剂量早期肠内营养对肠缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌高分解代谢的影响

唐少秋，程旻桦，段剑锋，高 涛

0 引 言

高分解代谢在重症患者中普遍存在，会导致骨骼肌消耗增加，进而引起获得性衰弱、住院时间延长和生活质量下降[1-2]。但目前对骨骼肌高分解代谢尚无有效的治疗措施。合理的营养支持策略有助于缓解骨骼肌消耗[3]。与肠外营养(parenteral nutrition, PN)相比，肠内营养(enteral nutrition，EN)能改善骨骼肌力量[4].有研究表明，不同的早期肠内营养(early enteral nutrition，EEN)途径对脓毒症导致的骨骼肌高分解代谢影响不同，并考虑这种差异与EEN对胃肠道内分泌功能的作用有关[5]。

研究表明，20%、40%、60%的EEN均能缓解肠缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion, I/R)后的小肠炎症反应[6]。但急性胃肠功能损伤在重症患者中普遍存在[7]，不同剂量EEN对急性胃肠功能障碍患者的影响不同，不恰当的EN喂养方案会增加喂养不耐受发生率[8-9]，而一旦发生喂养不耐受，会影响患者预后[10]。EN喂养剂量与喂养不耐受发生率密切相关。由此推测，明确EN最佳剂量，既能避免喂养不耐受对机体的影响，又能发挥对肠道的调节作用，这对调节骨骼肌高分解代谢有重要意义。因此，本研究拟通过观察不同剂量EEN对急性骨骼肌高分解代谢的影响，为更好的应对急性骨骼肌消耗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂健康成年雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，由南京大学医学院附属金陵医院比较医学科提供，动物许可证号：SCXK(沪)2018-0006。空肠造口管及中心静脉留置管购自美国Helix医疗公司；肠内营养(安素)购自雅培公司；肠外营养组分购自华瑞公司；MuRF-1抗体、MAFbx购自英国ABCAM；cDNA第一链合成试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒购自上海凡科维。给予大鼠12 h昼夜交替光照，术前12 h禁食水，术后禁食，自由饮水。

1.2方法

1.2.1 肠缺血再灌注损伤模型腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，于剑突下方做正中切口(约3 cm)，轻柔翻动肠管暴露根部，仔细寻找并分离肠系膜上动脉，用无创微血管夹闭血管根部，观察小肠色泽由红润转为苍白色且肠管周围小动脉搏动消失，表明缺血成功。将翻出肠管回纳，30 min后松开动脉夹，见小肠由苍白转为暗红及周围小动脉明显搏动，表明再灌注成功[6]。

1.2.2营养路径的建立经右侧颈内静脉建立肠外营养路径。在大鼠右侧颈部锁骨上做1.5 cm 大小纵行切口，分离并暴露右颈外静脉，轻柔剥离血管周围结缔组织，用显微外科剪斜行剪开血管前壁约 0.5 mm，由此置入无菌硅胶管约2 cm，结扎血管切口远心端，切口近端血管与硅胶管固定。置管末端经皮下于大鼠尾部中段穿出。回抽见回血证实置管成功，肝素稀释液封管备用。缝合颈部切口[6]。

经胃造口空肠置管建立EN路径。由左上腹将远端胃轻拉出，于前壁无血管处缝荷包备用，剪开荷包中间胃前壁约 0.5 cm，由此置入硅胶管，缓慢通过胃幽门部，放至幽门远端约4 cm，拉拢荷包打结，将胃轻柔回放至左上腹，牵拉造口管无滑动。由左上腹皮下做一约0.5 cm 切口，由此穿出造口管体外端，并再次行造口管固定。由皮下造隧道使置管末端于大鼠大鼠尾部中段穿出。体外段轻推空气无阻力，证实置管成功，接肝素帽备用[6]。

1.2.3营养支持方案EN干预大鼠给予肠内营养粉，溶于无菌注射用水(12.5 g 加水配置 50 mL)。PN干预大鼠按照 EN 成分配置营养液，按照等氮等热卡配置。所有大鼠均给予全热卡的60%作为营养支持总量，全热卡量参考Wu等[6]的研究(200 kcal/kg)。营养支持于造模后第2天启动。将32只大鼠分为60%PN组、20%EN+40%PN组、40%EN+20%PN组和60%EN组，每组8只大鼠。60%PN组大鼠全部由PN途径给予；20%EN+40%PN组大鼠全热卡总量的20%由EN途径给予，40%由PN途径给予；40%EN+20%PN组大鼠全热卡总量的40%由EN途径给予，20%由PN途径给予；60%EN组大鼠全部由EN途径给予。

1.2.4组织标本获取与保存所有大鼠均在营养支持72h后处死，用超量的2%戊巴比妥钠(0.5 mL/100 g)麻醉大鼠，先从心尖部取血2 mL待用，后用等渗盐水经心脏灌注(200 mL)。留取趾长伸肌称重，并保存至-80 ℃冰箱待测。

1.2.5骨骼肌代谢产物、萎缩蛋白水平及血炎症因子水平检测骨骼肌代谢代谢产物测定：高效液相色谱-质谱联合法检测大鼠趾长伸肌3-甲基组氨酸(3-methylhistidine，3-MH)及酪氨酸水平。解冻趾长伸肌，称取样本约0.2 g，加入预冷30%乙醇，振荡研磨后离心，取离心液上清。用标准品获取标准曲线，取样本液上机检测，记录样本峰浓度下面积，并根据标准曲线获取3-MH及酪氨酸数据。采用免疫印迹检测趾长伸肌萎缩蛋白肌环指蛋白-1(muscle ring finger-1，MuRF-1)和肌萎缩蛋白F-box(muscle atrophy F-box，MAFbx)的表达。取趾长伸肌研磨、裂解，通过SDS /PAGE 分离，并用Western blot分析。酶联免疫吸附法测定血IL-1β和TNF-α水平。

2 结 果

2.1 不同营养支持方案大鼠体重及趾长伸肌的改变同基础体重[(269.0±7.8)g]比较，所有大鼠在处死时体重显著下降[(227.9±10.8)g，P<0.001]。20%EN+40%PN组、40%EN+20%PN组体重改变程度较60%PN组、60%EN组显著减轻(P<0.05)，趾长伸肌/体重比显著增高(P<0.05)。见表1。

表1 不同营养方案对大鼠体重及趾长伸肌影响

2.2不同营养支持方案大鼠骨骼肌代谢产物及萎缩蛋白水平的改变与60%PN组比较，20%EN+40%PN组、40%EN+20%PN组大鼠3-MH及酪氨酸水平显著降低(P<0.05)。与60%EN组比较，20%EN+40%PN组、40%EN+20%PN组大鼠MuRF-1水平水平显著降低(P<0.05)，20%EN+40%PN组大鼠MAFbx水平显著降低(P<0.05)。见表2，图1。

图1 不同早期肠内营养方案对大鼠骨骼肌MURF-1和MAFbx的影响

表2 不同早期肠内营养方案对大鼠骨骼肌代谢产物及萎缩蛋白水平的影响

2.3不同营养支持方案大鼠血炎症因子水平的改变与60%PN组、60%EN组TNF-α、IL-1β水平比较，20%EN+40%PN组、40%EN+20%PN组显著降低(P<0.01)。见图2。

*P<0.01

3 讨 论

骨骼肌消耗是重症患者急性期特征性改变之一，并影响患者预后。既往研究表明，肠内营养对骨骼肌消耗有调节作用[5]，在本研究中，探讨了早期肠内营养不同剂量对急性骨骼肌消耗的作用，结果发现，与其它肠内营养剂量相比，20%EN+40%PN能改善肠I/R损伤导致的急性骨骼肌消耗。

已有研究表明，肠内营养可以维持肠上皮结构和功能完整、刺激肠蠕动、维持肠道内正常菌群、促进 IgA 释放等[11]。20%热卡需求量的早期肠内营养即能减轻肠上皮细胞氧化应激，发挥对肠上皮的保护作用[6]。急性骨骼肌消耗受炎症水平影响[12-13]，本研究前期发现，早期肠内营养能减少重症患者炎症因子水平[14]，而在本研究中发现，给予EN后大鼠血TNF-α、IL1-β水平会明显降低。因此推测，对全身炎症的改善可能是EN改善急性骨骼消耗的原因之一。

本研究结果与既往研究存在相似之处。Wu等研究发现[6]，给予20%EN、 40%EN、60%EN均能显著降低肠I/R大鼠肠NF-κB、HIF-1α水平。本研究发现与60%PN相比，20%EN+40%PN、 40%EN+20%PN能显著降低大鼠血TNF-α、IL1-β水平；但也发现与60%EN相比，20%EN+40%PN、 40%EN+20%PN大鼠血TNF-α、IL1-β水平也显著降低。目前尚不清楚出现这一改变的原因，在Wu等[6]研究中发现，同20%EN相比，给予40%EN后肠屏障通透性稍有增加，因此推测在肠I/R损伤后，由于急性肠道损伤的存在，机体对EN的耐受程度有个“阈值”，一旦EN的量超过这个阈值，会对肠道通透性、全身炎症反应有促进作用，而这一作用并不同于对肠壁的修复作用。

既往研究表明，EN+PN的营养方式有助于改善放射性肠损伤患者机体营养状况[15]。而本研究发现，即使均采用EN+PN的营养方式，20%EN+40%PN和40%EN+20%PN对急性骨骼肌消耗的影响也不尽相同。与20%EN+40%PN大鼠相比，40%EN+20%PN大鼠血TNF-α、IL1-β水平差异不明显，但骨骼肌消耗指标及体重降低程度却略高于20%EN+40%PN大鼠，我们推测与急性肠功能损伤有关。在本研究中，采用小肠I/R模型，该模型造成肠损伤和高分解代谢状态，这势必会影响小肠吸收功能，进而减少经肠道营养素的摄取。相比20%EN+40%PN大鼠有40%能量直接由PN供给，虽然40%EN+20%PN大鼠有40%能量由EN供给，但实际吸收的能量可能不足40%，这可能会造成后者骨骼肌消耗水平高于前者。

本研究方案与既往研究也存在不同之处。首先是目标能量的设定，根据以往研究，肠I/R大鼠日需能量约200 kcal/d[6]。已有研究也表明，对重症患者允许性低热卡喂养有利于患者预后[16-18]。因此，我们认为早期全热卡喂养对肠I/R损伤大鼠并不合理。基于指南中急性疾病早期应给予不超过70%全热卡量的营养支持的建议[19]，以及研究表明低于50%全热卡量的营养支持会导致机体瘦肉质减少及感染发生率增加[20-21]，本研究设定60%全热卡为允许性低热卡喂养剂量，但这个目标量是否符合大鼠急性应激期的需要并不明确，如果该目标剂量高于实际需要量，会造成机体代谢负担和代谢率增加，而如果该目标剂量低于实际需要量，又会由于营养供给不足导致骨骼肌分解增加。其次，本研究采用了早期PN营养支持，目的是在肠内营养剂量不同时总能量供给相同，以减少总能量不同对骨骼肌分解代谢的影响。但在2018年欧洲肠外肠内营养学会在指南中建议，只有当存在 EN喂养禁忌证时，才在3～7 d内启动PN[19]。然而，NUTRIREA-2研究观察了EN和PN对需要有创机械通气和血管加压支持的休克患者的影响，结果表明两组之间的感染率和28 d死亡率没有显著差异，而接受EN的患者发生肠缺血的风险明显增高[8]。Doig等[22]的研究发现，对于存在EN禁忌症的患者，入ICU 24 h内给予PN不增加患者死亡率、感染发生率，也不降低生存质量。在CALORIES研究中，重症患者入ICU后36 h内接受经EN或PN途径给予20 kcal/kg/day的营养支持，结果发现30 d死亡率无显著差异[23]。在本研究中，由于采用的是肠I/R损伤模型，并设定的是60%的低热卡喂养，因此才给予早期PN的营养支持方案。但需要注意的是，60%PN组大鼠骨骼肌分解代谢明显高于20%EN+40%PN组大鼠，这说明即使给予60%的总热量，仅通过早期PN途径对机体也是不利的。

本研究存在一定的局限性。第一是动物模型的选择。管饲肠内营养需要通过胃肠道发挥对机体的营养供给、代谢调节等作用，为保持模型肠功能的一致性，本研究采用肠I/R损伤模型。但需要注意的是，该模型造成的急性胃肠功能损伤程度较重，对肠内营养的耐受性较差，会影响肠内营养对骨骼肌分解的作用，因此，在该模型得出的结论需要在其它模型进行验证。第二是EEN影响骨骼肌高分解代谢的机制仍不明确。本研究虽然发现发挥作用可能与全身炎症反应相关，但是否存在其他的途径并不清楚，需要进一步研究。

综上所述，对于明确肠I/R损伤导致的急性骨骼肌消耗，不同剂量EEN的影响不同，其中，20%EN+40%PN的改善作用优于其它剂量的肠内营养。对于其它病因导致的急性骨骼肌消耗，EN最适合剂量仍需要进一步研究。