榆栀止血颗粒调控PI3K-Akt通路对子宫出血大鼠的保护作用*

池晓蓉 陈德招 王赵伟 李敏 姜艳玲

(1.厦门大学附属第一医院妇产科，福建 厦门 361000;2.福建医科大学附属协和医院妇产科，福建 福州 350001；3.中国制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006)

子宫出血是指与月经无关的子宫异常出血，是临床常见的妇科疾病[1-2]。子宫异常出血可导致子宫内膜病变、贫血甚至不孕等，其发病率较高，严重危害女性生命健康[3-4]。子宫出血机制复杂，近年来研究发现，子宫出血与子宫内膜上皮细胞凋亡、血管生成障碍、胞外基质异常及激素水平异常等子宫局部微环境改变有关[5-6]。而磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B,Akt)可调控细胞生长、增殖、凋亡，且与血管生成关系密切[7-8]，但PI3K-Akt通路在子宫出血病理过程中的调控作用研究较少。中医药在治疗子宫出血方面有其独特优势，榆栀止血颗粒(Yuzhi Zhixue Granule,YZZXKL)原名妇科止血颗粒，具有清热凉血、调经止血，临床上常用于治疗血热所致的月经过多，有文献报道发现在早孕子宫出血症方面止血效果较好[9]。然而YZZXKL治疗子宫出血的具体机制还不明确，这不利于YZZXKL的推广和应用，本研究通过建立大鼠子宫出血模型并设置PI3K-Akt通路抑制剂对此进行研究，以期阐明PI3K-Akt通路在YZZXKL治疗子宫出血中的作用，为临床合理用药及中医药走向国际化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级同遗传背景SD大鼠，体重 260～280 g,由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2018-0002。所有大鼠于本院动物房中饲养，饲养条件：自然光照，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%，噪音低于80分贝，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本试验经本院伦理委员会批准，试验动物符合3R原则。

1.1.2 主要试剂及仪器 YZZXKL(成药组成：地榆、栀子、墨旱莲、黄芩、茜草、贯众、槐花、蒲黄、拳参、大蓟、丹皮、白芍、侧柏叶(炒炭)、仙鹤草、当归等，批号：2003L01364,由山东新时代药业有限公司生产，规格：10 g/袋，国药准字Z20130019)；苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin Staining,HE)染色试剂盒(货号：LMO105,厂家：上海联迈生物工程有限公司)；米非司酮(货号：10412,购自北京凯瑞基生物科技有限公司)；米索前列醇片(货号：RK170327,购自深圳市洛克生化科技有限公司)；血清雌二醇(E2)、孕酮(P)酶联免疫(Enzyme linked immunosorbent assay,ELSA)试剂盒(货号：YE01847、YE01938,均购自上海远慕生物科技有限公司)；PI3K抗体、Akt磷酸化p-Akt抗体、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP-1)、(货号分别为：ab39307、ab38449、ab19956、ab32152、ab134184,均购自美国abcam公司)；BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶(货号分别为P0768,P0231,均购自美国Pierce 公司)。手动轮转式切片机(型号RM2125RTS,德国Leica公司)；光学显微镜(型号SMZ745,日本尼康公司)；蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号1659001、Trans-Blot SD,美国Bio-Rad公司)；凝胶成像仪(型号：GIS-500,Miulab公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠子宫出血模型建立及分组给药 参照文献[9]建立大鼠子宫出血模型，具体操作方法为：将健康雌性SD大鼠80只、雄性大鼠40只，按2∶1比例合笼饲养，于第2天8∶00进行阴道涂片检查，以发现精子为妊娠第1天，取妊娠大鼠60只，随机分为正常对照组(Normal组)、模型组(Model组)、YZZXKL低(4 g/kg)、高(16 g/kg)剂量组、PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组(LY组，0.3 mg/kg)、YZZXKL+LY组(16 g/kg+0.3 mg/kg)，各组10只。除Normal组外，其余各组大鼠均于妊娠第7天8∶00和18∶00时分别灌服米非司酮(13.8 mg/kg)和米索前列醇(135 μg/kg)复制子宫出血模型，并于大鼠阴道置于棉球，若次日取出棉球观察，若棉球上有血，表明造模成功；Normal组于相同时间灌胃给予等量生理盐水。各组大鼠均于造模成功后(妊娠第8 d)开始给药，YZZXKL参照文献[9]及人与动物等效剂量换算设置低、高剂量组，并用生理盐水稀释成0.4、1.6 g/mL的混悬液，LY294002参照文献[10]用DMSO溶液配制为0.03 mg/mL的混悬液，YZZXKL低、高剂量组按10 mL/kg的剂量灌胃给予相应浓度的YZZXKL混悬液；LY组按10 mL/kg的剂量腹腔注射给予相应浓度的LY294002混悬液；YZZXKL+LY组按10 mL/kg的剂量灌胃给予YZZXKL混悬液和腹腔注射给予LY294002混悬液；Normal组和Model组均按10 mL/kg的剂量灌胃给予生理盐水，并腹腔注射给予DMSO溶液。各组连续给药7 d,1次/d。

1.2.2 大鼠阴道出血量(UBQ)测定 各组大鼠均参照文献[9]在给药期间(妊娠第8 d～14 d)于阴道内置入重量为75～80 mg棉球一个(塑料薄膜包裹半侧，以防血液漏出和尿液返流)，次日分别于8∶00和18∶00将棉球取出，放入塑料袋中密闭冷藏保存，同时置换一个新棉球于阴道内，观察阴道出血情况。将各组大鼠每天收集的子宫出血棉球分别置于烧杯内，根据出血量的情况加适量50 g/L NaOH浸泡挤压、搓洗棉球血渍，浸洗后的溶液倒入一烧杯内保存。并用50 g/L NaOH浸洗3～4次，收集所有浸洗液，混匀，并记录所用50 g/L NaOH总体积，取5 mL浸提液过滤，取4 mL滤液，作为试验管。用血红蛋白吸管，吸取大鼠尾静脉血0.02 mL,加入50 g/L NaOH溶液4 mL,混匀作为空白对照管。将空白管和对照管在546 nm波长记录吸光度(A)值，根据公式子宫出血量(mL)=0.02×浸提液A值×浸提子宫血所用NaOH总体积(mL)/空白管A值/4,计算阴道出血量(UBQ)。

1.2.3 大鼠血液指标检测及子宫组织标本采集 各组大鼠在末次给药24 h后，用3%戊巴比妥钠麻醉，取颈总动脉血6 mL (不加抗凝剂)，全血以3000 r/min离心10 min,取上层血小板血浆 (PPP)用半自动凝血分析仪按照凝血四项说明书测定凝血四项，另取全血2 mL,静置30 min后以 3000 r/min 离心10 min,取上清液按ELISA试剂盒说明书检测血清E2、P含量。处死大鼠，取子宫组织，剪取0.5 g子宫内膜组织，用组织匀浆器匀浆、离心分离后取上清液于-20 ℃冰箱保存；剩余子宫组织，迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h保存备用。

1.2.4 HE染色观察子宫组织形态变化 取1.2.3于4%多聚甲醛中固定的子宫内膜组织，进行常规透明、浸蜡、包埋后、切成厚度为5 μm的切片。按HE试剂盒说明书进行染色，置于显微镜下观察组织形态变化。

1.2.5 Western blot法检测子宫内膜组织中PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF蛋白相对表达水平 取1.2.3于-20 ℃冰箱保存的子宫内膜组织匀浆液，于4 ℃冰箱中解冻后，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，蛋白定量BCA试剂盒检测蛋白总浓度后，取50 μg蛋白上样，进行电泳和转膜反应，TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h,TBST溶液清洗3次后，加入一抗(PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF、稀释倍数分别为1∶1000)、β-actin(内参，稀释倍数为1:2000)抗体，4 ℃摇床室温孵育过夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀释倍数1∶2000)，37 ℃摇床室温孵育1 h,TBST清洗3次后，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达。

2 结果

2.1 各组大鼠UBQ及血清激素E2、P含量检测结果 与Normal组相比，Model组和YZZXKL+LY组大鼠UBQ明显增高 (P<0.05)，E2、P含量均降低(P<0.05)。与Model组和YZZXKL+LY组相比，YZZXKL低、高剂量组大鼠大鼠UBQ均明显降低(P<0.05)，E2、P含量均升高 (P<0.05)，且YZZXKL各剂量组上述指标呈剂量依赖性；而LY组大鼠UBQ明显增高 (P<0.05)，E2、P含量均降低 (P<0.05)。Model组和YZZXKL+LY组相比，上述指标均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠UBQ及血清激素E2、P含量比较Table 1 Comparison of UBQ,E2 and P contents in serum of rats in each group

2.2 各组大鼠凝血指标TT、PT、APTT及FIB检测结果 与Normal组相比，Model组和YZZXKL+LY组大鼠TT、PT、APTT均明显升高 (P<0.05)，FIB降低 (P<0.05)。与Model组和YZZXKL+LY组相比，YZZXKL低、高剂量组大鼠TT、PT、APTT均明显降低 (P<0.05)，FIB升高 (P<0.05)，且YZZXKL各剂量组上述指标呈剂量依赖性；而LY组大鼠TT、PT、APTT均明显升高 (P<0.05)，FIB降低 (P<0.05)。Model组和YZZXKL+LY组相比，上述指标均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠TT、PT、APTT及FIB比较Table 2 Comparison of TT,Pt,APTT and FIB of rats in each group

2.3 各组大鼠子宫组织HE染色结果 Normal组大鼠子宫组织结构正常。与Normal组相比，Model组和YZZXKL+LY组大鼠子宫内膜固有层间质细胞增生、血管扩张、间质纤维化及炎性细胞浸润明显。与Model组和YZZXKL+LY组相比，YZZXKL低、高剂量组大鼠子宫内膜组织固有层基质细胞略有增生，可见少量新生血管生成，炎性细胞浸润明显减轻。而LY组大鼠子宫内膜上皮柱状细胞变性坏死，凋落，固有层纤维样变性和增生及血管扩张严重，可见明显的炎性细胞浸润至肌层，见图1。

图1 各组大鼠子宫组织HE染色图(400×)Figure 1 HE staining of uterus in each group

2.4 各组大鼠子宫组织PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表达结果 与Normal组相比，Model组和YZZXKL+LY组大鼠子宫组织PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相对表达水平均降低 (P<0.05)，MMP-2蛋白表达升高 (P<0.05)。与Model组和YZZXKL+LY组相比，YZZXKL低、高剂量组大鼠子宫组织PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF相对表达水平均升高 (P<0.05)，MMP-2蛋白表达降低 (P<0.05)，且YZZXKL各剂量组上述指标呈剂量依赖性；而LY组大鼠子宫组织PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相对表达水平均降低 (P<0.05)，MMP-2蛋白表达升高 (P<0.05)。Model组和YZZXKL+LY组相比，上述指标均无统计学意义(P>0.05)，见表3、图2。

图2 各组大鼠子宫组织PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表达免疫印迹图Figure 2 Western blotting of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF and MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group注：A.Normal组；B.Model组；C.YZZXKL+LY组；D.YZZXKL低剂量组；E.YZZXKL高剂量组；F.LY组

表3 各组大鼠子宫组织PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表达比较 Table 3 Comparison of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF,MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group

3 讨论

子宫异常出血是临床常见、多发的疑难病症，其中功能性子宫出血是子宫异常出血中最常见类型[11]。米非司酮联合米索前列醇诱导早孕大鼠子宫出血是子宫出血动物模型最常见和稳定的造模方法[12]。本研究用上述方法复制大鼠子宫出血模型，结果提示用米非司酮联合米索前列醇复制大鼠子宫出血模型后，Model组大鼠阴道出血增多，凝血时间延长，激素水平紊乱并伴随子宫内膜炎症和微环境改变，与文献[13-14]子宫出血模型指标变化一致，表明造模成功。

中医药在治疗子宫出血方面有其独特优势[15]，YZZXKL方中君药炒地榆凉血泻热、收敛止血，旱莲草入肝经血分而凉血止血，为治血热出血之要药，二者相伍，清热凉血止血，直中病机。臣药栀子清三焦之火而清热凉血，侧柏叶和槐花入血分清血热，而凉血止血；蒲黄可活血、收敛、止血，为活血行滞之要药，且对崩漏不止效果较好；四者炒制可入血分而清热凉血、收敛止血，并能辅助君药清热凉血。佐药：仙鹤草、拳参、大蓟、陈棕炭为清热止血佳品，且入血分而止血甚佳；丹皮与红茜草可凉血、止血、活血之功，可防苦寒滞留、除瘀；生地养阴生津，凉血止血；白芍柔肝敛阴而治热盛津伤；黄芩、贯众苦寒，直折其火。当归调经止血，为妇科之良药，与白芍、生地共伍，可养血而除烦，与蒲黄、丹皮同用，可理气行滞，和血止痛，且当归性温能散，味甘能缓，体润能补，引诸药以入冲任，共奏清热凉血止血，调经止血之功。尹艳艳等[9]发现YZZXKL即妇科止血颗粒对早孕大鼠子宫出血具有较好的治疗作用。本研究结果提示YZZXKL低、高剂量组大鼠阴道出血减少，凝血时间降低，激素水平升高，子宫内膜病变减轻且有新生血管生成，表明YZZXKL可提高子宫异常出血大鼠凝血功能、抑制子宫出血量，对异常出血子宫有一定的保护作用。然而其保护作用具体机制还不甚明确，本研究对此进行继续探究，以期为YZZXKL走向国际化提供理论依据。

子宫异常出血机制复杂，近来研究发现子宫内膜血管生成障碍是造成子宫出血的主要原因之一[6]。岳明等[13]发现激素可使子宫局部微环境发生改变，促进子宫内膜上皮和血管再生，是彻底终止子宫出血的重要机制，其中血管生成受到VEGF等不同生长因子的调节。MMPs可参与新生血管、胚胎形成以及伤口愈合[16]，黄琪等[17]发现黄芩炭可通过升高VEGF和降低MMP-2、MMP-9表达，降低早孕大鼠子宫出血量。本研究结果表明Model组大鼠子宫出血可能与VEGF降低和MMP-2表达升高有关。Nasirzadehd等[18]发现PI3K-Akt-eNOS通路可参与血管生成。PI3K激活后可与Akt结合并促进Akt磷酸化，激活的AKT可转移至细胞质和细胞膜，通过磷酸化作用激活eNOS促进其合成一氧化氮(nitricoxide,NO)，进而促进血管内皮细胞生成、增殖和防止血栓形成[19]。储佳佳等[20]发现柚皮苷可通过激活PI3K-Akt-eNOS通路，减轻高糖诱导的血管内皮损伤。本研究结果提示Model组大鼠子宫组织PI3K-Akt-eNOS通路被抑制，YZZXKL降低大鼠子宫出血量的作用，可能是通过激活PI3K-Akt-eNOS通路蛋白表达，促进子宫组织血管生成来实现的。为了进一步验证这一结论，本研究设置PI3K-Akt通路抑制剂LY研究，结果表明PI3K抑制剂可阻滞YZZXKL对PI3K/Akt通路的激活作用，减弱其对子宫出血大鼠的保护作用。进一步提示YZZXKL对异常出血的保护作用可能通过激活PI3K-Akt-eNOS通路实现。

4 结论与启示

YZZXKL可提高子宫异常出血大鼠凝血功能和激素水平，改善出血情况，可能通过激活PI3K-Akt-eNOS通路，促进血管生成实现。为阐明YZZXKL治疗子宫出血机制提供了一定参考价值。但PI3K-Akt-eNOS通路，促进血管生成抑制出血的机制十分复杂，且中药治疗疾病具有多靶点、多途径的作用，YZZXKL还可能通过其他途径抑制子宫出血，有待后续深入研究。