牛羊不同布鲁氏菌病血清学检测方法的比较

莫茜，阳爱国，郝力力，李春隆，袁东波，杨天俊，李盛琼，尹杰，高露，侯巍

（1.四川省动物疫病预防控制中心 成都 610041；2.西南民族大学生命科学与技术学院 预防兽医系成都 610041；3.仪陇县畜牧站 四川南充 637000；4.富顺县水产渔政服务中心 四川自贡 643000）

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌属细菌侵入机体引起的一种人畜共患传染病，动物感染布病主要表现为流产、睾丸炎、附睾炎等[1]，造成生产性能和繁殖机能的下降；全球有170多个国家和地区都报告过布病病例[2]，每年报告约50万人感染布病[3]，造成巨大的经济损失和社会公共卫生问题。我国将其列为乙类传染病、二类动物疫病。自21世纪以来，随着畜牧业发展，动物流动性增加等原因，我国牛羊布病感染状况总体呈上升趋势，近年来，全国动物疫控系统通过不断推进布病防治、监测和净化，取得了一定的成效。但受动物流动性大、基层防疫体系薄弱、淘汰病畜难度大、防治经费投入不足等因素影响，我国布病防控形势依然十分严峻。

布病的实验室诊断方法包括病原学方法和血清学方法。由于病原分离耗时长，对实验室生物安全级别要求高、存在风险等原因，因此并不常用；血清学诊断方法操作简单、适用性广，包括虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、乳牛全乳环状试验（MRT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光偏振测试（FPA）、胶体金免疫层析法（G ICA）[4]等。SAT法优点是价格便宜，可以定量测定抗体水平，具有较高的特异性，因此多用于布病检测的复核确认[5]。ELISA法操作方便，灵敏度高，一次可以完成大量样品的检测，在2018年纳入我国法定布病检测方法。c ELISA不仅可以检测交叉感染，还可以鉴别疫苗接种和野毒株感染[6]。胶体金免疫层析技术具有快速检测的特点，不需要配置仪器，但需要通过肉眼判定结果，敏感度不够高，存在假阳性和假阴性，比较适合于流行病学调查及野外现场检测[7]。

为检测对比各种试剂的有效性，确保布病检测结果准确，减少漏诊和误诊情况，本研究对3种布病血清学检测方法进行了比对试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测试剂布鲁氏菌病试管凝集试验抗原，购自中监所，批号20191030，布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒，购自青岛立见诊断技术发展中心，批号020162004，布鲁氏杆菌抗体高敏荧光检测试剂盒，购自成都微瑞生物有限公司，批号BRB20102116379。

1.1.2 血清样本血清样本为笔者所在中心保存的已知感染情况的牛羊血清，其中牛血清样本92份，羊血清样本92份。

1.1.3 设备与耗材96孔酶标仪，Bio-Rad公司产品；37℃恒温箱，上海福玛实验设备有限公司产品；精确的单道微量移液器和多道微量移液器，Transfe rpe tte公司产品；一次性移液器吸头：Axygen公司产品；高敏荧光分析仪，Wellra y®WR-1808。

1.2 方法

实验方法：试管凝集试验按照GB/T18646—2018进行操作与判定，酶联免疫吸附试验、高敏荧光免疫分析试验按试剂操作说明书进行操作和结果判定。

数据处理方法：对检测数据采用Excel处理，用SPSS 23.0软件进行统计学分析。采用假阳性率、假阴性率、一致率和Ka p pa值四种分析指标。

假阳性率与实验的特异性有关，即在金标准判断为阴性样本中，检测出为阳性的几率。假阴性率与实验的敏感性有关，即在金标准判断为阳性样本中，检测出为阴性的几率。一致率是检测方法的相关程度，指确诊的阳性与阴性样本且与两种检测方法结果相一致的总和与所有检测样本的百分比；Kappa值是医学上常用的一种用于计数资料的一致性评测，是评价一致性的测量值。一般认为，Kappa≥0.75，说明两种方法诊断结果一致性较好；0.4≤Kappa＜0.75，说明两种方法诊断结果一致性一般；Kappa＜0.4，说明两种方法诊断结果一致性较差。

2 结果与分析

2.1 牛不同布鲁氏菌病血清学检测试剂结果

采用试管凝集方法、竞争ELISA方法、高敏荧光检测方法对92份已知感染情况的牛血清（其中47份为真正感染的阳性血清，45份未感染的阴性血清）进行检测，比较它们的敏感性和特异性。结果见表1。

表1 3种布病血清学检测方法牛血清检测结果比较

结果表明竞争ELISA方法、高敏荧光检测方法Kappa值大于75%，试管凝集方法Kappa值小于75%，说明竞争ELISA方法、高敏荧光检测方法检测结果一致性较好，试管凝集方法一致性一般。试管凝集法的假阴性数最高，为12个，假阴性率为25.53%，高敏荧光检测方法假阳性数最高，为2个，假阳性率为4.44%。实验结果表明敏感性最高的是竞争ELISA方法，特异性最高的是试管凝集方法。

2.2 羊不同布鲁氏菌病血清学检测试剂结果

采用试管凝集方法、竞争ELISA方法、高敏荧光检测方法对92份已知感染情况的羊血清（其中13份为真正感染的阳性血清，79份未感染的阴性血清）进行检测，比较它们的敏感性和特异性。结果见表2。

表2 3种布病血清学检测方法羊血清检测结果比较

结果表明3种检测方法Kap pa值大于75%，说明3种检测方法检测结果一致性较好。试管凝集法和竞争ELISA方法的假阴性率均为7.69%，竞争ELISA方法和高敏荧光检测方法的假阳性率为1.27%。实验结果表明敏感性最高的是高敏荧光检测方法，特异性最高的是试管凝集方法。

2.3 分析与讨论

动物感染布病后症状不明显，通过临床诊断来确定动物是否患有布病就显得相对困难。血清学诊断方法由于操作简单、适用性广，是目前国内最常规的使用方法。本研究通过对3种布病血清学检测方法进行对比分析，以便为当前布病血清学诊断方法提供参考。

试验检测结果中假阳性率越高，说明容易出现阴性动物误诊的情况，造成扑杀动物不必要的经济损失；假阴性率越高，说明容易出现阳性动物漏检的情况，造成病原扩散，不利于养殖场或地区布病的净化工作。试管凝集法具有较高的特异性，成本低廉，是我国布病常用的确诊方法。但其敏感性相对较低，易出现漏诊的情况，且操作时间长，检测结果判定以人肉眼为主，易受人主观影响[8]。竞争ELISA法为我国现行国标推荐方法，本次比对试验结果显示一致性、假阳性率和假阴性率均有较优表现，操作简便，可适用于批量化大规模检测，在布病的检测中有良好的应用价值。胶体金免疫层析法在通常采用肉眼判断易造成人为误差，本研究中的高敏荧光检测方法采用荧光仪读数，避免了人为因素的干扰，在比对结果中也表现出了较好的一致性、假阳性率和假阴性率，操作简便，反应时间短，仪器简易可携带，适用于基层大规模检测。█