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重楼皂苷Ⅶ抗肿瘤机制研究进展

2021-10-27李劭恒牟永平王振飞贺晓花

中国医药科学 2021年18期
关键词:重楼皂苷耐药

李劭恒 牟永平,▲ 王振飞 卫 星 贺晓花 米 澜

1.内蒙古医科大学附属人民医院检验科,内蒙古呼和浩特 010020;2.内蒙古医科大学肿瘤分子诊断实验室,内蒙古呼和浩特 010020;3.内蒙古医科大学附属人民医院腹部外科B区,内蒙古呼和浩特 010020

肿瘤是严重危害人民生命健康的常见病,发病率高,治疗难度大。目前的治疗手段主要是手术,但因晚期患者失去手术机会,治疗效果不佳;其次是靶向药物治疗、化疗与放疗,靶向药物治疗常因耐药而降低疗效,而化疗与放疗引起的毒副反应较大。临床需要能够有效控制实体瘤进展,延缓肿瘤转移,对患者产生的毒副作用小,可以改善患者生存质量的治疗方法。中医药是我国几千年来智慧结晶的传承,是中华民族独具特色的治疗方法,在肿瘤的治疗中发挥着重要作用。现代药理研究表明,中药重楼主要活性成分重楼皂苷Ⅶ具有细胞毒作用、抑制肿瘤细胞生长、诱导癌细胞凋亡、调节人体免疫功能、影响癌基因表达、逆转耐药、抗肿瘤血管生成等抗癌药理作用。本文就重楼皂苷Ⅶ抗肿瘤主要作用机制的国内外研究进展做以综述。

1 重楼简介

重楼(Rhizoma Paridis)作为一味传统名贵药材,重楼以蚤休之名史载于《神农本草经》,2015年版中国药典记载:“本品为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.Mazz或七叶一枝花[Paris polyphylla Smithvar. chinensis(Franch.)Hara]的干燥根茎。”重楼为清热解毒类中药。其药性苦、微寒、有小毒,主入肝经,具有清热解毒,消肿止痛,凉肝定惊的功效[1]。重楼作为民间抗癌方剂主要成分,用于治疗肿瘤历史悠久,齐元富教授使用中药复方含重楼清热解毒,活血止痛,行气散结之功治疗肺癌[2]。陈其剑等[3]使用重楼软坚汤辅助放化疗治疗肺癌,戚桂玉等[4]使用金蟾片治疗消化道肿瘤,金炜东等[5]使用重楼提取物抗肝癌。

国内外研究者鉴定分离出来的重楼主要药用活性化学成分有甾体皂苷类、多种氨基酸、植物甾醇、三萜类、植物蜕皮激素、生物碱、黄酮类等。重楼中的化学成分80%为甾体皂苷,按苷元的不同可分为薯蓣皂苷元的糖苷和偏诺皂苷元的糖苷两大类,云南重楼根茎中分得7种甾体皂苷,其中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ为薯蓣皂苷,重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ为偏诺皂苷[6]。重楼皂苷Ⅶ为重楼抗肿瘤活性物质的有效成分之一,具有较强的抗癌活性,中文名称:重楼皂苷Ⅶ,中文同义词:重楼皂苷G,英文名字:Polyphyllin Ⅶ(PP7),化学分子式:C51H84O22,分子量:1049.18MOL,结构式见图1。

图1 重楼皂苷Ⅶ结构式

2 体内外研究

2.1 重楼皂苷Ⅶ抑制肿瘤细胞增殖和迁移

张欣等[7]研究发现PP7可抑制结肠癌SW-480细胞生长;王理槐等[8]研究发现PP7对人结肠癌HCT116细胞株的增殖产生抑制作用;其他学者研究发现PP7对不同肿瘤细胞株产生抑制作用,如胰腺癌Miapaca-2细胞[9]、人前列腺癌PC3细胞[10]、肺癌H460细胞[11]、人宫颈癌Hela细胞[12]、鼻咽癌细胞系HONE-1和NPC-039[13]、人口腔鳞癌(OSCC)中SAS和OECM-1细胞株[14]、肝癌细胞株HepG2[15]、脑胶质瘤U87-MG和U251细胞[16]、肺癌细胞A549和NCI-H1299细胞[17]、顺铂耐药细胞株A549/DDP[18]在PP7作用下增殖能力受到抑制。

2.2 阻滞肿瘤细胞增殖周期

通常每代肿瘤细胞的增殖都需要经历四个不同时期,即:DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)。

张欣等[7]研究发现PP7可明显抑制SW-480细胞增殖,通过线粒体和死亡受体途径诱导SW-480细胞凋亡,PP7可促进SW-480细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax及p21的 表 达,降 低Bcl-2、Cdk-4、Cdk-6和CyclinD1的表达,将SW-480细胞周期阻滞于G1期。刘帅等[10]通过PP7对人前列腺癌PC3细胞的作用发现PP7上调p21,抑制Cyclin D1周期调控蛋白,将前列腺癌细胞周期阻滞于G1期,抑制前列腺癌细胞的增殖。Song等[19]通过生物信息学分析显示,PP7调控结直肠癌的多种途径,包括内质网到高尔基体小泡介导的转运、对cAMP的应答、Ras蛋白信号转导、代谢途径、MAPK信号通路和细胞周期,细胞学实验发现PP7可显著抑制结直肠癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞和凋亡。Lin等[17]研究发现PP7下调cyclin B1,诱导G2/M细胞周期阻滞,触发细胞凋亡,在体内外均表现出较强的抑制肺癌细胞生长的作用。

2.3 诱导细胞凋亡

根据细胞的独特形态学特点,细胞的死亡方式分为坏死(necrosis)和程序性细胞死亡(programmed cell death),后者包括凋亡(apoptosis)、坏 死 性 凋 亡(necroptosis)自 噬(autophagy)及焦 亡(pyroptosis)[20]、胀 亡(oncosis)[21]、铁 死 亡(ferroptosis)[22]。其中凋亡与自噬研究的最广泛。诱导肿瘤细胞凋亡是大多数抗肿瘤药的主要作用机制,细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是由细胞内特定基因操纵、调控的一种生理性或病理性、自主性、有序性的自主性细胞死亡。PP7诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制包括癌基因的激活和抑癌基因的表达抑制,bcl-2/bax调节,Caspase的级联激活,细胞凋亡通过线粒体介导的内源性和细胞死亡受体介导的外源性途径进行,这两种途径都会转化为Caspase的级联激活[18]。内源性途径中,细胞色素C从受损的线粒体释放并引起Caspase-9的凋亡体依赖性激活,外源性Caspase-8激活,都可以导致下游Caspase-3激活,并最终使多聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)为内源性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,将细胞外信号转导至细胞及细胞核内,促进细胞有丝分裂,引起细胞生物学反应[23]。Zhang等[24]在肝癌细胞HepG2中研究发现PP7促进细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的去极化。上调细胞色素C、caspase-3、-8、-9和PARP及Bax/Bcl-2的水平,并呈剂量依赖性和时间依赖性,表明PP7通过内源性和外源性途径诱导HepG2细胞凋亡。PP7显著增强了MAPK通路主要成分JNK、ERK和p38的磷酸化,以及肿瘤抑制蛋白p53和PTEN的表达。MAPK抑制剂和ROS抑制剂显著抑制PP7诱导的细胞凋亡。得出结论PP7通过促进线粒体介导ROS的产生,激活MAPK和PTEN/p53通路,通过内源性和外源性途径诱导HepG2细胞凋亡。Lin等[17]在肺癌A549细胞中发现PPVI和PPVII上调肿瘤抑制蛋白p53,两种处理均显著提高了死亡受体Fasl-3、Fasl-5、Fas、cleaved PARP和活性caspase-3的表达水平。实验表明PPVI和PPVⅡ通过诱导G2/M细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。王理槐等[8]研究PP7能抑制人结肠癌HCT116细胞生长及诱导细胞发生凋亡,Caspase-3和PRAP相对表达,提示凋亡内源性途径参与了PP7诱导的HCT116细胞凋亡过程。相关研究[12]发现PP7对Hela细胞的半数最大抑制浓度(IC50)为(2.62±0.11)μm。PP7上调caspase-3、caspase-9、Bax表达,下调Bcl-2表达,提示PP7可以通过内源性凋亡途径诱导细胞凋亡。胡世尚等[9]主要以胰腺癌Miapaca-2细胞为对象,发现楼皂苷Ⅶ可通过诱导胰腺癌细胞凋亡,抑制干细胞标志物CD133的表达发挥抗胰腺癌作用。何昊等[11]研究PP7抑制人肺癌H460的作用和机制,结果发现,PP7可显著抑制H460影响其集落形成,并使细胞形态发生变化诱导凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力。H460细胞经PP7处理后,基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9显著降低,ICAD、Bcl-2表达降低,凋亡相关蛋白剪切型caspase-3、Bax表达增加,提示PP7体外可能通过调节基质金属蛋白酶抑制H460细胞迁移和侵袭,同时诱导凋亡的发生。He等[25]发现PP7处理后PI3K、磷酸化(p)-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB和p-NF-κB均下调,caspase-3活性增加,PARP切割增加,caspase激活的DNase抑制剂下调,表明PP7通过抑制人肺癌A549细胞的PI3K/Akt和NF-κB通路诱导凋亡细胞死亡。Chen等[13]在不同的人鼻咽癌细胞系(HONE-1和NPC-039)中,发现PP7影响ERK信号通路,通过激活caspase-3、-8和-9,以及Bcl-2、Bcl-xL和Bax蛋白表达的变化来诱导细胞凋亡。Hsieh等[14]在口腔鳞癌SAS和OECM-1细胞株中,发现caspase-3、-8和-9激活,PARP聚合酶剂量依赖性地诱导SAS和OECM-1细胞凋亡,Bcl-2和促凋亡相关蛋白的表达发生了变化,PP7通过激活ERK、Akt、p38 MAPK和JNK诱导口腔细胞凋亡,而ERK和JNK则诱导细胞自噬。

2.4 细胞自噬

细胞自噬是一种进化过程中非常保守的细胞降解系统,它可以分离蛋白质、聚合物和溶解的有机体进行降解,维持细胞的稳定生理状态,自噬是一把双刃剑,自噬对于肿瘤有双重作用,根据细胞环境和功能状态的不同,自噬可以提高细胞活性,或诱导细胞程序性死亡[26]。细胞自噬是一个动态过程,自噬体形成增加及自噬溶酶体降解过程被阻断,均可以导致自噬小体蓄积,使细胞死亡[27]。自噬被过度激活则导致细胞死亡,这种生物学行为被称为自噬性死亡,也叫做Ⅱ型程序性死亡[28]。PI3K/Akt/mTOR信号系统调控细胞自噬和促进细胞增殖。3-MA和CQ是PI3K的信号抑制剂。自噬在人鼻咽癌(NPC)中的潜在机制研究[13],发现在鼻咽癌异种移植模型中,PP7能有效抑制肿瘤的生长。LC3-Ⅱ和Beclin-1的含量均显著增加,提示PP7处理后的鼻咽癌细胞发生自噬。AKT、p38 MAPK和JNK参与了皂苷Ⅶ诱导的自噬。Hsieh等[14]发现皂苷Ⅶ处理后LC3-Ⅱ和beclin-1的表达均显著增加,提示口腔癌细胞中诱导自噬发生,而ERK和JNK介导了皂苷Ⅶ诱导的自噬。Zhang等[15]使用PP7诱导HepG2细胞的自噬,观察到LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化,P62的降解,斑点状lc3阳性结构的形成,以及自噬空泡的形成。PP7通过抑制PI3K/AKT/mTOR,激活JNK通路,诱导Bcl-2磷酸化,Beclin-1从Beclin-1/Bcl-2复合物中解离,诱导HepG2细胞自噬死亡。Pang等[16]研究报道了PP7对胶质瘤细胞具有细胞毒性作用,凋亡和自噬过程均参与PP7的细胞毒作用,PP7激活Bcl2/Bax通路,抑制自噬增强了PP7在胶质瘤细胞中的毒性。

2.5 抑制肿瘤细胞微环境

罗斌等[29]以C57BL/6小鼠肺癌移植瘤模型,探究肺癌肿瘤转移的局部“正虚”科学内涵。发现重楼的有效单体重楼皂苷Ⅶ通过下调免疫炎性蛋白S100A8表达,干预髓源性抑制细胞MDSCs的免疫抑制作用,进而抑制肺部转移前微环境的形成,提示其可能具有“扶正”的作用,初步揭示了扶正中药预防转移的可能机制,揭示“正虚伏毒”转移核心病机的生物学基础。

2.6 逆转耐药与化疗增敏作用

肿瘤耐药是化疗失败的主要原因,其发生机制与多药耐药有关。研究最多的是依赖ATP的“药物外排泵”P-gp蛋白过度表达导致肿瘤细胞耐药在肿瘤耐药及逆转耐药的复杂机制中,绕过多药耐药通过促进细胞凋亡逆转耐药,已成为目前关注的热点[30]。重楼皂苷Ⅶ通过抑制P-gp蛋白介导的药物外排作用,也显示着良好的抗肿瘤效应。PP7可下调耐药基因P-gp、MRP、BCRP表达,增加ADR细胞内蓄积,促进细胞凋亡,并通过PI3K/AKT/MAPK增强HepG2/ADR细胞对ADR的敏感性。其机制可能与重楼皂苷Ⅶ抑制P-gp蛋白介导的药物外排作用,以及引起线粒体功能障碍,促进细胞凋亡。王震等[31]研究结果显示,不同浓度的重楼皂苷Ⅶ对A549/DDP细胞的增殖均有抑制作用,具有明显的量-效关系;流式细胞技术分析显示,不同浓度的重楼皂苷Ⅶ作用于A549/DDP细胞后,凋亡早期细胞所占的百分比逐渐升高,显示出明显的促凋亡现象。重楼皂苷Ⅶ将A549/DDP细胞周期阻滞于G2期。提示重楼皂苷Ⅶ有促凋亡现象,从而逆转肺腺癌细胞耐药。Tang等[32]研究PP7通过PI3K/AKT/MAPK信号通路下调HepG2/ADR细胞耐药基因P-gp、MRP和BCRP的表达,增加细胞内ADR的积累,bax和caspase-3片段增加,bcl-2下调,促进细胞凋亡增加,PI3K/AKT/MAPK通路受到抑制,提高了细胞对ADR的敏感性。

已观察到EGFR-TKI的获得性耐药导致疾病进展。Wang等[33]使用吉非替尼敏感细胞PC-9和吉非替尼获得性耐药细胞H1975,通过体外和体内实验研究PP7在NSCLC中对吉非替尼增敏作用,发现PP7通过G1期阻滞和P21信号通路的调节来提高吉非替尼获得性耐药NSCLC细胞对吉非替尼的增敏作用。

在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中,以顺铂(DDP)为基础的化疗反应较差并耐药而导致治疗失败。Feng等[18]发现PPI和PP7显著抑制A549/DDP细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。进一步研究其机制发现,PP1和PP7可以上调p53基因表达,诱导caspase依赖性凋亡,抑制CIP2A/AKT/mTOR通路。通过PP1和PP7诱导mTOR抑制,介导自噬的激活。PP1和PP7可作为DDP耐药NSCLC的候选药物。Feng等[34]进一步研究蛋白磷酸酶抑癌因子(CIP2A)的表达与上皮-间质转化(EMT)的关系。发现EMT促进耐药性,PPI和PP7能够逆转EMT,抑制细胞增殖,上调p53和caspase依赖信号通路,增强了DDP诱导的A549/DDP细胞的凋亡,抑制CIP2A/AKT/mTOR信号轴,提高A549/DDP细胞对DDP的敏感性。Pang等[16]在U87-MG和U251脑胶质瘤细胞中PP7给药后,发现活性氧的产生增加,AKT/mTORC1活性被抑制,应用NAC去除活性氧效应可减低PP7诱导的细胞死亡、自噬及其对AKT/mTORC1信号通路的影响。此外,PP7与胶质瘤患者常用的化疗药物替莫唑胺(TMZ)联合使用可产生协同作用,PP7通过抑制MGMT(6-O-甲基鸟嘌呤-DNA修复甲基转移酶)表达,减低了TMZ的耐药性。Cui等[35]研究发现重楼皂苷B(Polyphyllin B)和PPV7对肺癌细胞具有协同抗肿瘤作用,这种协同抗肿瘤作用是基于它们单一促凋亡作用的增加,Polyphyllin B和PVⅡ可以激活caspase-3、-8和-9等促凋亡基因,诱导Beclin1裂解成Beclin1-c,从而抑制Polyphyllin B诱导的大细胞肺癌NCI-H460细胞自噬,增强细胞凋亡作用。

3 总结与展望

综上所述,祖国医学抗肿瘤药物重楼药用价值较高,重楼总皂苷及其单体具有广泛的抗肿瘤活性,能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,其作用机制包括阻滞细胞周期运转、诱导凋亡、调节肿瘤微环境、逆转肿瘤耐药性等多个方面。由于国内外对于PP7单体抗肿瘤活性的研究较少,其具体机制还不明确,目前多集中于凋亡及自噬机制的探索,是否通过多种途径在此过程中起作用还需进一步研究。PP7是重楼皂苷主要有效成分,研制疗效确切、毒副作用小、能延长患者生存期,可应用于临床的重楼皂苷新药,是今后中药重楼皂苷抗肿瘤课题研究的方向。

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