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多肽修饰的金纳米颗粒对小鼠三阴性乳腺癌细胞的靶向光热效应研究

2021-10-27孙博蒙艺灵温涛孟洁刘健许海燕

北京生物医学工程 2021年5期
关键词:孵育靶向培养基

孙博 蒙艺灵 温涛 孟洁 刘健 许海燕

0 引言

根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据,乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大癌症[1]。乳腺癌的治疗方式包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗等[2],其中靶向治疗是一种有效的新型治疗方案,具有特异性强、毒副作用相对较小的优势[3-4]。三阴性乳腺癌细胞雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和原癌基因Her-2均为阴性,缺乏靶向的受体,目前的靶向治疗策略主要是通过开发其他潜在靶点,提高治疗效果。靶向药物如针对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的贝伐珠单抗可应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等多种靶向治疗,但因其治疗乳腺癌过程中严重不良反应发生率增加[5],已被 FDA 撤销其用于乳腺癌治疗的适应证。针对乳腺癌1号或2号基因(BRCA1/2)突变的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂奥拉帕利(Olaparib)和他拉唑帕利(Talazoparib)已经被 FDA 批准用于治疗转移性胚系乳腺癌突变、Her-2阴性乳腺癌,能较好地改善三阴性乳腺癌的无进展生存期,但是对总生存期无明显改善[6-7]。因此,开发其他三阴性乳腺癌的潜在靶点并进行有效靶向治疗具有重要意义。据文献报道,乳腺癌肿瘤组织高表达热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)[8-10],因此HSP很有可能是一个潜在靶点。本研究将自主研发的靶向HSP60的多肽分子P17[11]连接到具有良好生物相容性、高光子热转换效率的金纳米颗粒(aurum nanoparticle,AuNP)上,构建了靶向光热治疗系统(AuNP-P17),研究在激光照射下AuNP-P17对小鼠三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用,为乳腺癌的靶向治疗提供一种新的靶向治疗系统。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

试剂:柠檬酸钠、氯金酸、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司);FITC标记的P17(国平药业有限公司);胎牛血清(Gibco公司);改良型RPMI 1640培养基、青-链霉素(Hyclone公司);小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);抗HSP60抗体、FITC标记的驴抗兔的IgG(Cell Signaling Technology);CCK-8 试剂盒(Dojindo Molecular Technologies,Inc)。

仪器:动态光散射仪(Zetasizer Nano ZS90,Malvern instruments Ltd.);紫外-可见-近红外分光光度计(Lambda 950,Perkin Elmer);透射电子显微镜(TEM-1400 plus,JEOL Ltd.);流式细胞仪(AccuriTMC6 flow cytometer,BD Biosciences);激光器(MDL-HD,长春新产业光电技术有限公司)。

1.2 金纳米颗粒的制备

使用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备金纳米颗粒[12]。将150 mL柠檬酸钠(2.2 mmol/L)加入到圆底烧瓶,90 ℃水浴下保持磁力搅拌,加入1 mL氯金酸(25 mmol/L),反应30 min后再加入1 mL 60 mmol/L柠檬酸钠和1 mL 25 mmol/L氯金酸,反应30 min后再加入1 mL 60 mmol/L柠檬酸钠和1 mL 25 mmol/L氯金酸,反应30 min后冷却至室温,即为AuNP溶液。

1.3 P17修饰金纳米颗粒(AuNP-P17)的制备

在上述AuNP溶液中加入P17溶液,充分混匀,在30 ℃的水浴中避光孵育30 min。离心弃上清,向沉淀中加入超纯水,超声使沉淀完全分散,得到AuNP-P17溶液。

1.4 纳米颗粒理化性质表征

使用紫外-可见-近红外分光光度计检测纳米颗粒的吸收光谱。设置检测波长为200~1100 nm,波长间隔为4 nm,在室温下进行。取1 mL AuNP溶液,通过离心浓缩后重悬到100 μL去离子水中,取5 μL溶液置于铜网上,通过透射电子显微镜观察。将1 mL AuNP和AuNP-P17溶液,通过Zetasizer Nano ZS90分析仪测定颗粒的动态光散射水合粒径和Zeta电位。所有的测量均在室温下进行。

1.5 细胞培养

4T1细胞培养于含有10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640完全培养基中。细胞培养条件为37 ℃和5 %的CO2。细胞传代比例为1∶5,大约每隔2 d传一次代。选择复苏后传代3~20次的细胞进行实验。

1.6 细胞活性分析

将4T1细胞以1×104个/孔的密度接种到96孔细胞培养板中,贴壁后弃去培养基,用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤2次,加不同浓度P17、AuNP和AuNP-P17,共孵育24 h后弃去培养基,用PBS洗2次,每孔加入100 μL培养基和10 μL CCK-8试剂,1 h后吸取90 μL到酶标板中,测量450 nm处的吸光度。每组设3个平行,只含有培养基和CCK-8组设为空白对照,未用材料处理的4T1细胞活性设为100%。

当使用激光照射时,将4T1细胞与金原子浓度为100 μg/mL的AuNP和AuNP-P17孵育24 h(对照组加入等体积培养基),弃去培养基,重新加入100 μL完全培养基。将激光器功率调整为1.922 W/cm2,照射时间为0 min、2 min、4 min和6 min。照射完毕立即使用便携式热电偶温度计测定溶液中心温度,弃去培养液,加入CCK-8工作液,1 h后吸取90 μL到酶标板中,测量450 nm处的吸光度。每组设3个平行,将只含有CCK-8试剂和完全培养基的组设置为空白对照,激光照射0 min处理的4T1细胞的活性均设置为100 %。

1.7 检测细胞HSP60的表达

将4T1细胞收集到1.5 mL离心管中。离心弃上清,PBS再洗涤1次。向细胞沉淀中,分别加入PBS或抗HSP60抗体(用PBS稀释200倍),4℃下孵育40 min。用PBS洗涤2次,再加入FITC标记的驴抗兔的IgG二抗,在4 ℃避光孵育30 min。用PBS洗涤2次后,每管加入200 μL的细胞悬液,过300目网筛,用流式细胞仪检测FITC的荧光强度。每组均设置3管平行,将PBS处理组设置为对照组,抗HSP60抗体处理组设置为实验组。

1.8 检测P17与细胞的结合

将4T1细胞收集到1.5 mL离心管中。离心弃上清,PBS再洗涤1次。向细胞沉淀中,分别加入200 μL的PBS或2 μmol/L的P17,混合均匀,在37℃条件下孵育2 h。然后用PBS洗涤2次,每管加入200 μL的PBS分散细胞。最后,过300目的网筛,用流式细胞仪检测P17所标记的FITC的荧光强度并分析P17与4T1细胞表面的结合。每组均设置3管平行,将PBS处理组设置为对照组,P17处理组设置为实验组。

1.9 光学显微镜下观察纳米颗粒与4T1细胞的结合

将4T1细胞以1×105个/孔的密度接种至12孔板,贴壁后弃去培养基,用PBS洗涤两次,加入1 mL的AuNP或AuNP-P17(材料用完全培养基稀释,金原子浓度均为100 μg/mL),对照组加入1 mL的完全培养基。放置于培养箱分别培养4 h和8 h。取出细胞培养板,吸除材料,用PBS洗涤3次,加入新鲜培养基,放置于倒置显微镜观察并拍照。

1.10 统计学分析

统计学显著性通过采用SPSS 17.0的独立两样本t检验分析,以及单因素和双因素重复测量的方差分析。实验数据以均值加减标准差表示(mean±SD)。P小于0.05被认为差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。

2 结果

2.1 纳米颗粒表征

通过紫外-可见-近红外分光光度计检测制备得到的AuNP,可见其等离激元共振吸收峰在528 nm[图1(a)]。利用透射电子显微镜观察AuNP,可见金纳米颗粒呈圆球形[图1(b)]。通过动态光散射(dynamic light scattering,DLS)检测金纳米颗粒修饰前后的粒径和Zeta电势(表1),结果显示,金纳米颗粒表面连接P17后,平均粒径从(51.8±0.1)nm变为(52.1±2.2)nm,配对t检验显示P=0.866。Zeta电势从(-29.3±0.3)mV变为(-29.6±0.6)mV,配对t检验显示P=0.395。

图1 金纳米颗粒的紫外-可见-近红外吸收光谱

表1 AuNP和AuNP-P17的粒径和Zeta电势

2.2 乳腺癌细胞4T1中HSP60的表达

使用流式细胞仪检测4T1细胞中HSP60的表达和与P17的结合,结果显示,4T1细胞中显著高表达HSP60[图2(a)],P17可以与HSP60显著性高结合[图2(b)]。

图2 4T1细胞中HSP60的表达(a)和P17与HSP60的结合(b)

2.3 P17和纳米颗粒对4T1细胞活性的影响

利用流式细胞仪考察P17对4T1细胞的影响。细胞活性结果表明,P17在20 μmol/L范围内对4T1细胞活性几乎没有影响[图3(a)]。使用不同浓度AuNP和AuNP-P17与4T1细胞共孵育时,结果表明,在金原子浓度不超过100 μg/mL时,两种纳米颗粒对4T1细胞活性均无显著影响[图3(b)]。

图3 不同浓度的P17(a)、AuNP和AuNP-P17(b)对4T1细胞活性的影响

2.4 乳腺癌细胞对纳米颗粒的摄取

通过光学显微镜直接观察细胞培养环境及细胞状态的改变。如图4所示,在4 h和8 h时,AuNP处理组与对照组的溶液颜色无明显变化,而AuNP-P17处理组的细胞及其周围均可见红色覆盖,通过光学显微镜图观察,可见有明显的颗粒存在于细胞。

图4 小鼠乳腺癌细胞4T1与金纳米颗粒孵育4 h和8 h时的光学显微镜图

2.5 金纳米颗粒对4T1细胞的靶向光热杀伤作用

与金纳米颗粒共孵育后的细胞在激光照射时的温度变化见表2。结果显示,AuNP-P17处理组在激光照射4 min后,细胞培养基的温度从(22.9±0.4)℃升高到(52.0±3.9)℃;对于AuNP处理组,细胞培养基的温度只升高到(47.2±0.6)℃,而对照组仅升温到(38.2±2.4)℃。通过检测4T1细胞在激光照射后的活性,可以看到AuNP-P17处理组在激光照射4 min时,细胞活性已降低到(1.3±2.8)%,AuNP处理组的细胞活性降低到了(64.1±6.8)%,而对照组细胞的活性与无激光照射相差不大,细胞活性为(100.0±3.2)%。各组之间两两比较差异具有统计学意义(图5)。

图5 与金纳米颗粒共孵育后的4T1细胞在激光照射不同时间时的相对活性

表2 4T1细胞在不同孵育条件下激光照射后的温度

3 讨论

柠檬酸钠是制备金纳米颗粒最常用的还原剂和稳定剂,通过调节柠檬酸钠的浓度,可制备不同粒径的单分散金纳米球形颗粒[12]。入射光电磁场可引起金纳米颗粒表面自由电子的集体振荡,并且在特定光波长处达到最大振荡幅度,即表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)。制备得到的柠檬酸钠包被AuNP溶液呈现红色。通过对修饰P17前后的金纳米颗粒进行DLS表征,发现金纳米颗粒修饰前后的粒径和电势区别不大(P> 0.05),表明P17的修饰并不影响金纳米颗粒的稳定性。

热休克蛋白是细胞在应激条件下产生的一组高度保守的蛋白质,研究表明,肿瘤细胞中HSP60通常会高表达[13]。P17是一种靶向HSP60蛋白的多肽分子,可以与细胞膜或细胞内的HSP60高效结合,生物相容性良好,且可在动物体内应用[11]。由于4T1细胞中HSP60高表达且与P17强结合(图2),因此P17对4T1细胞具有强靶向性,可用于靶向4T1细胞系统的构建。不同浓度的P17、AuNP和AuNP-P17与4T1细胞孵育后对细胞活性影响很小(图3),表明P17、AuNP和AuNP-P17具有良好的生物相容性。光学显微镜观察表明,4T1细胞对修饰了P17的纳米颗粒AuNP-P17具有更强的摄取能力,与流式检测和分析结果一致。

光热疗法作为一种新的肿瘤治疗方法,具有高选择性和低副作用的优点。金纳米颗粒因具有高光子热转换效率,是良好的光热治疗载体[14-15]。通过检测与材料孵育后的细胞在激光照射时的温度变化(表2),说明AuNP-P17处理组具有更高的升温效率。将此光热效应运用到杀伤肿瘤细胞,通过检测4T1细胞在激光照射后的活性,结果证明AuNP-P17可以显著性促进对4T1细胞的杀伤。

4 结论

本研究基于乳腺癌细胞高表达HSP60这一特征,将靶向HSP60的多肽P17与具有高光热转换的金纳米颗粒相结合,构建了靶向乳腺癌细胞4T1的光热杀伤系统AuNP-P17,该系统细胞毒性低,具有良好的生物相容性,并促进了细胞的摄取。与AuNP-P17共孵育后的4T1细胞在激光照射下温度显著升高,表明AuNP-P17具有靶向性和光热效应,实现了对4T1细胞的高效杀伤,为其进一步用于光热治疗研究奠定了基础。

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