铁调素在缺血性脑卒中后铁稳态失衡中的调控作用

吴海辉，葛金文,2

(1.湖南中医药大学中西医结合学院，长沙 410208； 2.邵阳学院，湖南 邵阳 422000)

据脑卒中流行病学调查显示，我国年龄>40岁人群首次脑卒中的标化发病率平均每年增长8.3%，每年因脑卒中死亡的患者约190万例[1]。数据表明，我国已成为全球脑卒中发病率最高的国家[2]。脑卒中是成人致残和死亡的首要病因，严重影响我国居民的生活质量[3]。在脑卒中的分型中，缺血性脑卒中的发病率约为77.8%，是最常见的脑卒中类型[4]。人脑中的铁具有严格的调节规律，可以防止因铁过量或不足而导致的相关疾病。目前，大脑中铁超载已成为帕金森病、阿尔茨海默病等部分神经退行性疾病的共同特征[5]。铁稳态失衡作为脑血管神经损伤的新机制已受到广泛关注。临床观察发现，脑卒中患者存在血清铁水平升高[6]。在脑缺血动物模型的缺血侧观察到铁调素表达水平升高[7]。在临床病例和脑缺血动物模型中均观察到铁和铁调素的病理性改变，因此铁损伤作为脑缺血氧化应激损伤的诱因应引起高度重视[8]。关于铁稳态调节，“两个中心、三个体系、网络调节”工作模式的提出具有一定创新性[9]。现就铁调素在缺血性脑卒中铁稳态失衡中的调控作用予以综述。

1 脑铁稳态及铁稳态失衡

1.1脑铁稳态 作为多种生物功能的关键元素，铁参与机体氧转运、电子转运、氧化还原反应、细胞分裂、核苷酸合成和髓鞘形成等一系列复杂的生理过程[10]。铁在脑组织中也具有重要作用，其通过血液循环进入中枢神经系统后被吸收至大脑的多种神经元中，作为酶辅基参与神经递质及少突胶质细胞髓鞘蛋白的合成等多种脑生理活动[11]。另一方面，细胞内铁过量可增加氧化负荷，导致细胞功能损伤，当大脑中铁稳态失衡时，铁超载和铁缺乏均会对脑组织产生影响。有研究证实，脑缺血时铁离子释放增加，大量游离铁造成神经元细胞内脂质氧化物代谢失调，催化产生大量自由基，而氧化应激反应可导致脑组织损伤及铁代谢相关疾病[12]。因此，为了维持机体正常功能，大脑中必须有一个精确且严格的调控机制来调节铁平衡。

生理状态下，脑内铁离子水平处于摄取、储存和释放的动态平衡。铁在细胞膜上的运动需要特定的运输系统，许多蛋白分子参与脑铁代谢的平衡。在正常情况下，机体铁的摄取主要通过转铁蛋白/转铁蛋白受体(transferrin/transferrin receptor，Tf/TfR)系统，但也有较少部分铁以非转铁蛋白结合铁的形式被利用[13]。从肠上皮细胞释放入血的铁离子，在血液中主要以三价铁离子(Fe3+)与Tf结合(Fe3+-Tf)的形式存在，部分二价铁离子(Fe2+)在氧化酶的作用下被氧化为Fe3+后与Tf结合形成含铁转铁蛋白；血液中的Fe3+-Tf与细胞膜表面的TfR特异性识别后，形成Fe3+-Tf/TfR复合体，并在细胞膜内吞作用下进入细胞[14]。由于血脑屏障的作用，铁离子不能直接进入脑内，需要特殊的转运系统转入。脑毛细血管内皮细胞是组成血脑屏障的细胞，由于细胞膜上也存在TfR表达，因此机体可通过Tf/TfR系统将铁离子转运至脑内[15]。二价金属转运蛋白1是一种广泛表达的蛋白质，可将在酸性环境中内吞体释放的Fe2+转移至细胞质的不稳定铁池中。而脑内神经元主要通过受体介导的内吞机制摄取铁。因此，为了维持细胞内铁的动态平衡，机体必须存在一种铁排泄通道。目前已知的哺乳动物体内唯一的铁输出蛋白是膜铁转运蛋白，膜铁转运蛋白作为铁离子输出的唯一通道蛋白，可监测细胞内铁离子的水平[16]。机体正是通过这种上下游铁转运蛋白的相互配合，调控包括脑在内的铁的摄取、储存和释放的动态平衡。

1.2铁稳态失衡 在许多神经性疾病中均出现脑内铁含量异常，如创伤性脑损伤和脑缺血患者均出现铁稳态失衡，其铁离子沉积显著增加[3]。脑铁超载后氧化应激的过度激活和脂质过氧化的大量积累均可导致脑神经元损伤[17-18]。脑缺血发生后，TfR表达增加、膜铁转运蛋白表达减少，细胞内铁离子沉积显著增加，提示铁代谢异常可能是导致脑缺血后损伤的潜在机制[19]。脑缺血损伤发生后铁稳态失衡导致大量铁离子沉积，而铁超载可致线粒体结构和功能不可逆性损伤，进而导致大量活性氧类的产生和脂质过氧化物积累，从而引起细胞铁死亡[20]。铁死亡的机制包括由芬顿反应产生的超负荷的氧化自由基以及脂质过氧化损伤[21-22]。在芬顿反应中，Fe2+与过氧化氢反应生成过量的羟自由基，引起神经细胞过氧化损伤和继发的细胞毒性，导致脑组织损伤加重，虽然细胞内存在自身抗氧化剂(如谷胱甘肽和超氧化物歧化酶)可以减少脑组织损伤，但抗氧化剂在脑缺血或出血期间对抗氧化应激的作用仍十分有限[23]。苏永永等[24]用去铁胺预处理局灶性脑缺血小鼠发现，小鼠的神经行为学评分降低，脑梗死和脑水肿面积缩小，表明降低铁离子水平可改善脑梗死症状、减轻缺血后的神经损伤。廖君等[25]用去铁酮处理脑缺血再灌注损伤大鼠发现，大鼠TfR和二价金属转运蛋白1的表达下调，脑铁离子沉积减少，脑缺血再灌注后神经损伤减轻。目前关于铁稳态的研究仅局限于铁相关转运蛋白的变化方面，且缺乏实验和临床研究证据，因此铁稳态失衡对缺血性脑卒中的作用还需进一步深入研究。

2 铁调素

铁调素是一种由肝细胞产生的小分子多肽类激素，在机体铁稳态调控过程中发挥枢纽作用。2001年，Pigeon等[26]发现，铁调素对体内铁稳态具有调节作用。铁调素由多个小分子多肽构成，其中含有25个氨基酸的多肽是其发挥作用的主要形式，铁调素分子中含有8个高度保守的半胱氨酸残基，并通过4个分子内二硫键连接成发夹结构[27]。除了在肝脏中表达外，铁调素在脑组织中也有表达，且在脑不同区域铁调素的表达量也不同，在皮质、纹状体、小脑中铁调素的表达水平较高，在海马、丘脑及脊髓中也有一定表达[28]。由于脑不同区域的生理结构和功能存在差异，因此铁调素在脑区差异化的表达可能与某些神经系统疾病损伤相关，如脑卒中、脑出血、阿尔茨海默病和帕金森病等。近来研究发现，铁调素还在神经元和大脑脉络丛上皮细胞中表达[29]。铁调素在脑组织细胞中的表达，对于维持脑细胞铁稳态平衡至关重要。已有研究证实，铁调素可通过调节肠的铁吸收、巨噬细胞铁回收和肝细胞铁储存调控铁水平[30]。而铁调素的产生又受铁水平的调节，当铁充足时，细胞可产生更多的铁调素，限制铁吸收；当铁缺乏时，细胞产生铁调素的量反而减少，使更多的铁进入血浆。铁调素对铁代谢的调控作用主要通过降解已知的细胞内唯一铁输出蛋白——膜铁转运蛋白实现，以此控制细胞与血液循环铁的流通状态[31]。病理状态下，循环铁增加通过反馈调节机制导致铁调素的表达上调，铁调素与膜铁转运蛋白形成复合物，诱导膜铁转运蛋白发生泛素化并负性调节使细胞内铁离子的输出量减少[32]。因此，铁调素的表达异常是铁稳态失衡的关键。目前以铁调素为靶点的药物研发已成为铁代谢研究领域的热点，针对铁调素的靶向治疗可有效改善脑卒中发生后的铁稳态失衡，深入研究铁调素的调控机制对于病理性铁过载的治疗具有潜在的临床应用价值。

3 铁调素参与缺血性脑卒中后铁稳态失衡的调控机制

铁调素是铁稳态网络调节过程的中心调控分子，参与铁稳态的动态调控过程，其自身的表达调控也受到严密的调节。研究发现，机体存在多种途径可调控铁调素，生长代谢需求、炎症环境、系统铁负荷等因素均可影响铁调素的表达[6]。不同的调控途径间又存在交叉作用，但影响铁调素表达的分子调控机制目前尚未明确，需进一步研究阐明。

3.1骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-血幼素(hemojuvelin，HJV)/Smads信号通路 BMP6及其下游的Smads蛋白被认为是调控铁调素的经典途径[33]。BMP6基因含有7个外显子，编码513个氨基酸大前体，包括N端信号肽序列、适当折叠的前体蛋白和C端分泌成熟肽序列[34]。细胞膜表面的BMP受体包括Ⅰ型受体和Ⅱ型受体两个亚型，BMPⅠ型受体和Ⅱ型受体共同作用将信号传递给细胞内的Smads蛋白，Smads蛋白作为细胞内信号转导蛋白，参与靶基因的转录激活过程[35]。如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)与Smads蛋白形成受体复合物进入细胞核内，具有激活或抑制靶基因表达的作用[36]。研究发现，BMP6在成人中枢神经系统神经元及其轴突中均显著表达，在少突胶质细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞中也有表达[37]。由此可见，BMP6在脑中发挥重要作用。

BMP6与HJV可形成二聚体复合物，BMP6-HJV复合物首先通过与细胞膜表面的BMPⅡ型受体结合，将信号传递给BMPⅠ型受体并使之磷酸化，形成膜表面四聚体复合物，然后再向细胞内传递信号，使Smads蛋白家族中的Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，磷酸化后的Smad1、Smad5、Smad8与Smad4形成复合物并转运至细胞核，结合铁调素启动子启动转录，从而达到调节铁调素的目的[38]。目前已证实，给予富含铁的饮食和注射右旋糖酐铁均可增加小鼠肝脏中磷酸化Smad1、Smad5、Smad8的表达，且Smads蛋白的表达增加与铁调素表达水平升高相关[39]。另有研究发现，存在BMP6基因致病性变异的患者铁调素水平显著降低[40]。有文献报道，人类杂合子BMP6缺陷可导致轻度至中度迟发性铁超载，表现为血清铁蛋白水平升高和肝脏铁储备增加[32]。可见，作为调控铁调素表达的上游信号分子，BMP6水平可反映细胞内的铁水平。但也有研究发现，在BMP6缺陷小鼠中仍存在慢性铁负荷后铁调素水平升高[41]。由于脑卒中损伤后铁代谢紊乱具有多途径参与的特点，因此细胞内可能还存在其他调控铁调素的途径。

根据HJV蛋白的作用特点其可分为两种类型：①膜性HJV，可作为BMP的共受体参与BMP6调控铁调素的经典途径；②可溶性HJV，可减少BMP-HJV复合物，对铁调素的表达起抑制作用[42]。此外，在跨膜丝氨酸蛋白酶6(transmembrane serine proteases 6，TMPRSS6)基因突变的小鼠体内，血清铁调素水平显著升高，向小鼠体内注射TMPRSS6则铁调素的表达受到抑制，可见TMPRSS6对铁调素的表达具有抑制作用[43]。研究表明，TMPRSS6可切割HJV蛋白导致BMP6-HJV复合物形成减少，在铁调素调节中发挥负性调控作用[44-45]。因此，深入研究TMPRSS6与HJV蛋白的作用机制有利于探索抑制铁调素表达的负性调节通路。研究还发现，HJV与再生蛋白Neogenin有一定相互作用，Neogenin可抑制HJV的分泌并调节BMP诱导的铁调素表达和铁稳态[46]。然而，Zhao等[47]发现，Neogenin可与间变性淋巴瘤激酶3(一种促进铁调素表达的BMPⅠ型受体)发生共免疫沉淀，表明Neogenin可作为促进BMP-HJV/Smads受体复合物形成的支架参与调控铁调素表达的过程。

3.2白细胞介素(interleukin，IL)-6/Janus激酶(Janus kinase，JAK)2信号通路 炎症和氧化应激在脑缺血引起的神经元损伤中起重要作用。随着对铁稳态研究的不断深入，发现炎症细胞因子也可调控铁调素的表达[48]。小胶质细胞作为大脑中的巨噬细胞，在脑缺血损伤发生后立即被激活并释放IL-6等炎症细胞因子，同时促进星形胶质细胞的活化[49]。在生理病理条件下，星形胶质细胞参与维持大脑细胞功能，其可清除活性氧类和过量的神经递质、控制离子和水的流出，同时释放神经营养因子、调节血脑屏障的通透性以影响铁离子的转运摄取[50]。活化后的星形胶质细胞可增加IL-6与膜表面受体的结合，激活与受体偶联的JAK，磷酸化的JAK催化信号转导及转录激活因子3，最终以JAK2/信号转导及转录激活因子3二聚体的形式进入细胞核中与铁调素基因的启动子特异性结合，诱导铁调素高表达[51]。铁调素高表达可加速膜铁转运蛋白的内化降解，使细胞铁的输出减少，导致神经元细胞中铁离子沉积并通过芬顿反应产生大量活性氧类，加重细胞损伤[21]。这与在缺血性脑损伤中发现的游离铁及铁蛋白水平升高具有一致性，产生了一种由铁代谢紊乱、炎症和氧化应激形成的恶性循环[8]。因此，有效控制缺血性脑卒中后的炎症反应，有利于缓解脑铁超载，减少铁调素的表达和减轻组织损伤。

3.3Tf/Smads信号通路 含铁转铁蛋白是影响铁调素表达的另一个关键调节因子。Bartnikas等[52]给予低转铁蛋白水平的小鼠补充转铁蛋白，可导致小鼠体内铁调素表达水平升高。Muckenthaler等[53]发现，细胞内转铁蛋白饱和度与铁调素表达变化一致，揭示了转铁蛋白水平对铁调素的重要作用。含铁转铁蛋白与遗传性血色素沉着症候选基因(hemochromatosis gene，HFE)蛋白竞争性地结合细胞膜表面的TfR1，由于HFE与TfR1的结合力较弱，导致HFE从TfR1上分离并转移至TfR2上，形成HFE/TfR2复合物，HFE/TfR2复合物诱导Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，磷酸化的Smad1、Smad5、Smad8与Smad4结合共同进入细胞核激活铁调素基因的表达[54]。Latour等[55]通过比较HJV基因单敲除小鼠与HFE和TfR2双基因敲除小鼠发现，双基因敲除小鼠的铁水平与HJV基因单敲除小鼠相似。表明HJV可能参与了HFE或TfR2途径，但转铁蛋白介导的转运是否与BMP6受体的作用途径存在交叉还有待进一步探究。

3.4其他途径 铁诱导的线粒体氧化损伤通过引起线粒体脂质过氧化和脂质的释放而激活核转录因子红系2相关因子2，并导致BMP6表达水平升高，在铁超载的情况下，核转录因子红系2相关因子2激活可提高铁诱导活性氧类的能力，并通过BMP6作用于铁调素[56]。除BMP6外，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7、BMP9等也可在体外诱导铁调素的表达[57]。研究发现，BMP2与HJV结合的亲和力与BMP6和HJV结合的亲和力相同，在通过血清铁、炎症和红细胞生成调节铁调素表达中具有一定作用[58]。表明BMP2与BMP6的功能具有一定的重叠，为了解铁调素调节通路提供了新途径。而新发现的转录辅助抑制因子SHP(small heterodimer partner)是一个铁稳态负调节因子，其可通过抑制与铁调素启动子结合的Smad1和Smad4 复合物的形成，抑制转录的发生[59]。

在复杂的疾病病理生理进程中，铁被感知并转化为信号调节铁调素表达的机制目前尚不明确。因此，以BMP-HJV/Smads、IL-6/JAK2、Tf/Smads等为代表的信号通路的调控(图1)仍是未来研究的热点。

4 小 结

目前，静脉溶栓和血管内治疗已成为治疗缺血性脑卒中的常用手段[60]。中药在临床治疗中可显著改善患者症状。现代药理研究发现，具有益气活血功效的中药有效成分具有抗炎、抗氧化和神经保护作用，在减轻铁超载方面具有一定积极意义[61]。廖君等[62]用益气活血的脑泰方和去铁酮干预脑缺血模型大鼠后发现，细胞内铁离子沉积减少，铁调素水平显著降低。铁稳态失衡可能是缺血性脑卒中的重要病理机制。铁调素作为铁稳态网络调控的关键分子，受到多种机制的调控。通过研究铁调素参与缺血性脑卒中后铁稳态失衡的作用机制，可以为缺血性脑卒中患者的治疗提供新思路。但目前关于中药改善铁超载方面的研究较少，且多集中于病理状态和用药前后铁转运相关蛋白的变化方面。因此，未来仍需多中心、大样本的临床试验探究铁调素在缺血性脑卒中后铁稳态失衡中的调控作用，为临床提供更多治疗策略，改善缺血性脑卒中患者的预后。

Neogenin：再生蛋白；TMPRSS6：跨膜丝氨酸蛋白6；HJV：血幼素；BMP6：骨形态发生蛋白6；BMPR：骨形态发生蛋白受体；HFE：遗传性血色素沉着症候选基因；TfR：转铁蛋白受体；Tf：转铁蛋白；Hepcidin：铁调素；Translation：翻译；IL-6：白细胞介素-6；JAK2：Janus激酶2；STAT3：信号转导及转录激活因子3；Transcription：转录；Hepcidin mRNA：铁调素信使RNA；export：输出；Nucleus：细胞核