HPLC法同时测定鹿红方中7种成分

李素丽， 周 泉， 曹岚岚， 林启焰， 程雪梅， 杨 涛， 周 华*， 王长虹*

(1.上海中医药大学附属曙光医院中西医结合心血管病研究所, 上海 201203；2.上海中医药大学中药研究所，上海市复方中药重点实验室，中药标准化教育部重点实验室，上海 201203)

鹿红方又名补肾活血方，由鹿角、红花、淫羊藿、补骨脂、女贞子、山茱萸、沉香7味药材组成，方中鹿角咸温入肾，补肾阳、益精血；红花辛温入心，活血通经，两药共为君药；淫羊藿、补骨脂、女贞子、山茱萸共助鹿角平补肾之阴阳，为臣药；沉香纳气归肾以助诸补肾药，使本方补而不滞，是为佐使药，诸药合用，共奏补肾活血之功效[1]。现代药理研究表明，该方可抑制心肌纤维化[2]，影响血浆RASS产物[3-4]，鹿角中鹿茸多肽[5]、红花中羟基红花黄色素A[6]、补骨脂中补骨脂素均对心血管系统具有保护作用[7-9]，淫羊藿中淫羊藿苷[10-11]可增加心脏收缩功能，山茱萸中没食子酸能显著降低自发性高血压大鼠的血压[12]、莫诺苷和马钱苷对糖尿病小鼠心肌有一定的保护作用[13]，女贞子中特女贞苷[14]能明显抑制肾小球系膜细胞凋亡。 本实验建立HPLC法同时测得鹿红方中没食子酸、羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷的含量，并进行方法学验证，以期为该方质量标准的制定提供依据。

1 材料

Agilent 1100 series 型高效液相色谱仪(配置Agilent DAD检测器，美国安捷伦科技公司)；BSA124S-CW电子分析天平(万分之一)、BT25S电子分析天平(十万分之一)[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。羟基红花黄色素A(批号AF9081601，纯度>98%)、马钱苷(批号AF7110703，纯度>98%)、补骨脂苷(批号AF9102107，纯度>98%)、异补骨脂苷(批号AF9102108，纯度>98%)对照品均购于上海鸿永生物科技有限公司；沉香四醇(批号DST190801-042，纯度>98%)、没食子酸(批号 DST190715-008，纯度>98%)对照品均购于成都乐美天医药科技有限公司；特女贞苷(批号2018011201，纯度>98%)对照品购于成都普利斯生物科技有限公司。鹿角、红花、补骨脂、淫羊藿、山茱萸、女贞子、沉香饮片均购于上海康桥中药饮片有限公司，经上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定为正品。乙腈(美国Fisher公司)；甲酸(批号G0960200，上海安谱科学仪器有限公司)；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脱(0～10 min，5%A；10～15 min，5%～10%A；15～35 min；10%～18%A；35～40 min，18%～25%A；40～60 min，25%～35%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长230 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.没食子酸 2.羟基红花黄色素A 3.马钱苷 4.沉香四醇 5.补骨脂苷 6.异补骨脂苷 7.特女贞苷

2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为2.71、8.61、7.61、6.43、17.42、11.88、45.00 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 按处方量称取药材约125 g(鹿角15 g、红花9 g、补骨脂20 g、淫羊藿30 g、山萸肉15 g、女贞子30 g、沉香6 g)，精密称定，加1 500 mL水煎煮75 min，滤过，滤液减压浓缩至1 000 mL，作为水煎剂，取适量用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按处方量比例称取缺红花、补骨脂、山茱萸、女贞子、沉香的剩余处方药材约22.5 g(鹿角7.5 g、淫羊藿15 g)，精密称定，加750 mL水煎煮75 min，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 线性关系考察 取“2.2”项下对照品溶液适量，稀释后摇匀，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.6 精密度试验 取高、中、低质量浓度对照品溶液，同一天内在“2.1”项色谱条件下进样测定6次(日间)或连续测定3 d(日内)，测得没食子酸、羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷日间精密度RSD分别为1.68%～2.78%、1.10%～2.59%、1.10%～2.93%、1.14%～2.73%、1.35%～2.16%、1.22%～3.24%、0.73%～2.32%，日内精密度RSD分别为1.42%～2.36%、2.38%～6.74%、1.46%～2.77%、1.36%～2.71%、0.84%～1.40%、1.12%～4.01%、0.89%～3.56%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取水煎液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷含量RSD分别为2.04%、2.78%、2.51%、2.78%、0.75%、2.49%、0.96%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取水煎液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、1、4、6、12、16、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷峰面积RSD分别为1.6%、2.7%、2.5%、2.9%、0.9%、1.8%、1.3%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密量取各成分含量已知的供试品溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，加入50%、100%、150%水平对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷平均加样回收率分别为102.58%、98.85%、100.17%、98.87%、98.61%、97.32%、98.53%，RSD分别为3.72%、3.08%、3.92%、2.02%、1.21%、2.02%、1.14%。

2.10 样品含量测定 取水煎液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(n=3)

3 讨论

2020年版《中国药典》中，羟基红花色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂素、异补骨脂素、特女贞苷均为鹿红方中相应药材的质控指标[15]，虽然补骨脂素、异补骨脂素含量在方中较低，但补骨脂苷、异补骨脂苷在体内可分别转化为两者[16]，并且在水煎液中含量较高，故将羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、补骨脂苷、异补骨脂苷、特女贞苷作为质控指标；没食子酸为鹿红方中山茱萸的指标成分，含量较高，也选择作为质控指标；淫羊藿苷、莫诺苷虽然可见于鹿红方水煎液中，但含量较低，不宜作为质控指标，故未将两者含量进行测定；鹿角中含有大量鹿茸多肽，可介导心肌干细胞分化，修复受损心肌[12]，但本实验所建立的方法无法对多肽含量进行测定，后期将对其作单独处理。

本实验在色谱条件确定过程中，分别以水(含0.1%甲酸)-乙腈、水(含0.1%甲酸)-甲醇为流动相，并对其梯度进行摸索，发现前者洗脱时色谱图基线平稳，色谱峰峰形对称，分离度较好。再对检测波长进行考察，最终确定为230 nm，此时出峰数目多，各成分响应、分离度均理想。