带档板摇瓶中流场数值模拟及克拉维酸发酵培养研究

冯 涛， 夏建业， 储 炬

（1. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2. 国药集团威奇达药业有限公司，山西大同 037300）

在微生物发酵的整个过程中，反应器的混合、传质和剪切是影响发酵过程的3 个流场特征参数，这些参数与微生物发酵过程相关联，因此反应器内流场结构对于微生物发酵起着至关重要的作用，是反应器设计和发酵过程优化中的一项重要技术[1]。工业发酵开发过程离不开摇瓶，菌种筛选、培养基优化、发酵条件等都在摇瓶中进行。此外，种子的培养条件优化可通过摇瓶进行培养放大[2]。因此，摇瓶内的流场结构对菌种筛选、培养基优化、种子培养条件优化、发酵培养工艺放大等有十分重要的指导作用[3-4]。

克拉维酸(Clavulanic Acid, CA)是由棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）经过好氧发酵产生的一种次级代谢产物，它是一种高效的β-内酰胺酶抑制剂。据报道克拉维酸发酵培养基中最佳氮源为大豆蛋白[5-6]，最佳碳源为甘油[7-8]，由于发酵培养基中营养成分比例较高，在发酵过程中发酵液黏度较高，严重影响发酵过程的气液传质效果，从而影响克拉维酸的生物合成。

在液体发酵过程中，溶解氧的供给是合成克拉维酸分子的必要前提[9]，这就要求进行克拉维酸发酵的反应器内有较强的搅拌混合作用和足够的供氧能力，以满足克拉维酸高效合成中高耗氧的需求。由于棒状链霉菌为放线菌，随着菌丝的生长，菌丝会出现结网现象，导致发酵液黏度明显增加，高耗氧、高黏度是克拉维酸发酵过程的一个显著特点。为保证克拉维酸的正常合成，工业生产中在搅拌转速达到最高速度后，往往被迫通过提高罐压、降温等措施来降低代谢活力以满足代谢最低要求[10-12]。因此，通过优化搅拌和设备参数，加强气液传质，改善发酵微环境是优化克拉维酸发酵的研究方向。

本文运用计算流体力学（CFD）对带档板与不带挡板的3 L 摇瓶内的流场结构进行详细模拟，并根据模拟结果对其中的种子培养过程及发酵过程分别进行分析，为进一步放大克拉维酸发酵过程提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 菌种

棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus），由国药集团威奇达药业有限公司提供。

1.2 培养基

种子培养基主要成分：甘油、豆饼粉、糊精。调节培养基pH 至7.0，在121 ℃下灭菌30 min。

摇瓶发酵培养基主要成分：黄豆饼粉、甘油、淀粉、吗啉丙磺酸（MOPS）、三油酸甘油酯、K2HPO4及微 量 元 素（ NaCl 0.100 g/L，MgCl20.100 g/L，CaCl2·2H2O 0.100 g/L，FeCl30.030 g/L，CuCl20.005 g/L，MnSO40.005 g/L，ZnCl20.005 g/L，ZnSO40.065 g/L）；调节培养基pH 至6.9，在121 ℃下灭菌30 min。

1.3 培养条件

摇瓶种子培养：将解冻后的孢子悬液0.5 mL 接种于100 mL 种子培养基中，28 ℃恒温培养72 h，摇床转速为（160±10）r/min。

摇瓶发酵培养：将0.25 mL 种子液接种于发酵培养基中，25 ℃恒温培养168 h，摇床转速为（160±10）r/min。

摇床：旋转振荡摇床，型号SPH-322D，振幅Φ100 mm，购自上海世平实验设备有限公司。

显微镜：Olympus BX-53，显微成像系统Cellsens。

1.4 带挡板与不带挡板的3L 培养用摇瓶

三角摇瓶是实验室进行发酵工艺研究最便利的生物反应器，它也被用在克拉维酸摇瓶工艺开发过程中[13-15]。摇瓶内流场结构的充分解析，对理解工业发酵罐克拉维酸发酵工艺具有十分重要的研究价值。本文使用的三角摇瓶全容积3 L，购自博美玻璃仪器厂。带有一个挡板的摇瓶如图1 所示。

图1 带一个挡板的3 L 摇瓶Fig. 1 3 L Flask with one baffle

1.5 摇瓶流场的CFD 模型

摇瓶在摇床上的运动是一种绕转动轴转动的特殊公转，并且转动过程中瓶身前后左右各面的方位不变（设前后左右表面分别对应南（S）北（N）西（W）东（E）4 个方位，在公转过程中这几个方位保持不变）。在CFD 模型中不能通过简单的绕轴运动对此运动进行模拟，因为瓶体中不同位置的流体微团在同一时刻受到的转动离心力是不同的，需要对其进行建模。

以上运动可以看作是摇瓶不动，而摇瓶内的发酵液流体微元均受到重力及绕该流体微元周期性运动的离心力的共同作用。基于此，可通过以下模型对每个流体微元进行受力分析。如图2 所示，摇瓶中发酵液流体微元各自绕其固定的轴作旋转运动，旋转角速度为 ω ，旋转半径为r，流体微元同时受到离心力fc及重力fg的作用，并且满足：

图2 摇瓶运动过程中发酵液流体微元受力分析Fig. 2 Analysis of the fluid micro-element force in the fermentation liquid during shake flask movement

这样摇瓶内流体共受到3 个方向的质量力的作用，相应的加速度为：

1.6 摇瓶流场中气液传质数值模型

1.7 摇瓶气液两相流场模拟

采用Euler-Euler 法对摇瓶内的气液两相流动进行建模，气相和液相均作为连续相处理，按照培养基装量位置对流场进行初始化，此交界面以下为液体，交界面以上为气体。摇瓶内气液两相流动形成的自由表面通过流体体积法（VOF）进行追踪。

摇瓶内流体网格采用Ansys ICEM CFD 生成，利用四面体网格进行划分，最大网格尺寸小于5 mm，不带挡板摇瓶中共生成40 万网格，带挡板摇瓶中生成60 万网格。

流场建模及数值模拟在Ansys CFX12.0 中进行，湍流模型选用k-ε 双方程模型。

2 结果与讨论

2.1 摇床上摇瓶周期性旋转运动形成流场的模拟

摇床的运动是振荡（Shaking）而不是旋转（Rotation），其工作原理如图3 所示。因此，对摇床上安装的摇瓶内流体运动的模拟不能采用简单的绕轴旋转进行建模，应该在考虑摇瓶绕轴1 公转外，同时考虑摇瓶绕自身轴心（轴2）的反向自转。为探究可用于模拟摇瓶中流体流动的真实模型，分别比较了单纯绕轴1 公转的模拟结果，以及利用1.5 节中讨论的模型算法模拟摇瓶的运动。

图3 摇床运动原理示意图Fig. 3 Schematic diagram of shaker movement principle

模拟结果显示，采用单纯绕轴1 的旋转无法模拟发酵液在摇瓶内的真实运动。在形成一个相对稳定的倾斜方向朝向旋转轴的自由表面的流动状态下，不存在流体微元间的相对运动，使得混合和相间传质较小，完全不符合真实摇瓶中的发酵液流动[18-19]。真实情况下，摇瓶在绕摇床旋转中心轴运动的同时以相同大小的角速度逆向自旋，从而保持前后左右各面方位不变。运用文中提出的旋转离心加速度模型对摇瓶进行模拟，如图4 所示。

图4 利用本文提出的旋转离心加速度模型模拟得到的不同时刻气液流动自由表面（80 r/min）Fig. 4 Gas-liquid flow free surface at different time by the rotational centrifugal acceleration model proposed in this paper (80 r/min)

2.2 不同转速下挡板结构对摇瓶中流场结构的影响

通过CFD 模拟，比较了带档板与不带挡板的3 L摇瓶中形成的流场。重点考察了不同搅拌转速对摇瓶中形成的气液交界面面积、气液比表面积、平均液膜传质系数（平均kL）以及平均kLa的影响，如图5 所示。从图5 可以看出，在较低转速（40 r/min）下，挡板结构对以上参数均无显著影响。随着转速增加（80～160 r/min），同转速下带挡板的摇瓶内比不带挡板的摇瓶内形成的气液交界面面积和气液比表面积明显更大。而对于平均kL，挡板的作用则更加复杂。随着转速增加，带挡板和不带挡板的摇瓶内平均kL呈现出不同的变化趋势，80 r/min 转速下，不带挡板摇瓶中平均kL明显优于带挡板摇瓶中平均kL；转速再增加时（120～160 r/min），挡板对平均kL的提升作用明显，不带挡板摇瓶中平均kL没有出现提升作用，反而相对80 r/min 下的平均kL有所下降。综合来看，带档板摇瓶内kLa随转速的增幅明显大于不带挡板摇瓶内kLa的增幅，并且转速越高增幅越明显。

图5 不同转速下带档板与不带挡板摇瓶中传质参数流场预测值对比（装液量600 mL）Fig. 5 Comparison of flow field prediction values of mass transfer parameters between shaker flask with baffle and without baffle at different speeds (filling volume 600 mL)

通过进一步比较不同转速下摇瓶内的流场结构，尤其是气液交界自由表面的流场结构，可以更直观地研究挡板结构对摇瓶中流场结构的影响。图6比较了不同转速下带档板和不带挡板摇瓶内气液两相流动时的气液交界自由表面形貌。采用相同颜色标尺来表示流场中kLa的大小分布，红色表示kLa最大值，蓝色表示kLa最小值，其他颜色表示kLa介于两者之间。从图6 可以直观地看出，同样转速下带挡板摇瓶中形成的自由表面具有更多褶皱，而不带挡板摇瓶中形成的自由表面更加光滑，这就是气液交界面面积在带挡板摇瓶中更大的原因[20]。

图6 不同转速下带档板和不带挡板摇瓶中形成的气液自由表面对比Fig. 6 Comparison of gas-liquid free surface formed by shaking flask with baffle and without baffle at different rotating speeds

模拟结果显示，最大kLa往往分布在气液自由表面沿旋转方向的尾部边缘，最小kLa则大多分布在沿旋转方向前沿的内部区域。文献[21]报道旋转摇瓶中的气液传质多发生在液体在摇瓶壁面划过后形成的薄层液膜中，按此理论气液传质应该在自由表面划过的尾部最为剧烈，这与本文的研究结果一致。

表1 示出了不同转速下带档板与不带挡板摇瓶中平均剪切应变率Y˙ 大小的比较。从表1 可以看出在较低的转速（40 r/min）下两者平均剪切应变率相对偏差不大（2%）外，在80、120、160 r/min 转速下带档板摇瓶比不带档板摇瓶相对偏差平均值高出27.3%。较高的平均剪切应变率一方面促进了气液传质与混合能力，同时也为菌丝体断裂形成更多分支提供了有利条件。

表1 不同转速下带档板与不带档板摇瓶中平均剪切应变率（SSR）大小对比Table 1 Comparison of average shear strain rate (SSR) in shaking flask with and without baffle at different rotational speeds

2.3 不同装液量下带档板摇瓶中的模拟分析

进一步考察带挡板结构的摇瓶中装液量对流场参数的影响，如图7 所示。由图可见装液量对平均kL（图7（c））的影响较对气液交界面面积（图7（a））的影响明显，随着装液量的增加平均kL增加幅度远大于气液交界面面积增幅。图7（b）中，随着装液量增加气液比表面积迅速降低。综上，随着装液量增加平均kLa先增大后降低（图7（d）），在所考察的转速下最优装液量为650 mL 左右。这与发酵实验得到的结果一致。

图7 带档板摇瓶中不同装液量下流场参数CFD 模拟预测值（摇床转速120 r/min）Fig. 7 CFD simulation prediction value of flow field parameters under different liquid loading in shaking flask with gear plate (rotating speed of shaking table 120 r/min)

2.4 摇瓶中流场对克拉维酸种子培养及发酵培养的影响

为验证CFD 模拟结果，在不带挡板摇瓶及带档板摇瓶中分别进行了种子培养过程及发酵培养过程的实验研究。

带档板摇瓶及不带挡板摇瓶中克拉维酸种子培养过程的实验对比如图8 所示。由图8（b）可知，带档板摇瓶中菌体量明显小于不带挡板摇瓶菌体量。该结果验证了同样操作条件下，由于挡板结构的存在使流场中形成更大的剪切作用，从而细胞的表观比生长速率受到抑制，形成了相对较低的菌体浓度。培养结束前即使在菌浓相对较低的状态下，带档板摇瓶中美兰褪色时间仍比不带挡板摇瓶褪色时间短（图8（c）），充分说明了带档板摇瓶中气液传质能力更高，从而表现出更高的克拉维酸生产能力，导致更高的发酵液黏度（图8（d））。

图8 带档板与不带挡板摇瓶中种子培养过程参数变化对比Fig. 8 Comparison of seed culture parameters in shaking flask with baffle and without baffle

进一步比较了带档板和不带档板3 L 摇瓶中克拉维酸发酵培养过程，研究了装液量分别为150、250、500、650、900 mL 时的菌丝变化，在1000 倍显微镜下观察并记录菌丝特征，见表2 和图9。经过对比菌丝分支程度、内涵物颗粒发现，随着装液量的增加，两种摇瓶中均出现不同程度的供氧不足，菌丝形态出现了显著的差异。带有挡板的摇瓶，前期生长阶段菌丝快速生长并伴随大量分支，当装液量大于650 mL时，菌丝有少量结团；而没有挡板的摇瓶，在相同装液量的情况下，菌丝快速生长易形成团球，导致氧和营养物质无法传递至菌团内部，影响菌团内菌丝正常代谢。通过对比培养后期菌丝特征，可以看出带有挡板的摇瓶中，菌丝呈现明显的次级代谢特征，菌丝分化断裂伴随有内含物的积累。整个过程菌丝的形态变化进一步证明了档板结构更容易形成较大剪切，促使培养前期菌丝产生更多分支，加速前期菌丝快速生长，从而有利于培养后期的菌丝分化。

图9 3 L 带挡板与不带挡板摇瓶中克拉维酸发酵菌丝形态（装液量650 mL，培养120 h）Fig. 9 Clavulanic acid mycelium morphology in 3 L flask with baffle and without baffle (Filling volume 650 mL, cultivation 120 h)

表2 带档板和不带挡板摇瓶中不同装液量下菌丝形态对比（培养120 h）Table 2 Comparison of mycelium morphology under different filling volume in shake flasks with baffle and without baffle (cultivation 120 h)

图10 示出了带挡板和不带挡板摇瓶中装液量对克拉维酸发酵的影响，随着装液量的增加，两种摇瓶表现出明显相反的克拉维酸合成量变化趋势。随着装液量的增加，无挡板摇瓶中克拉维酸合成量呈下降趋势；而带挡板摇瓶正好相反，克拉维酸合成量随装液量增加而增加，当装液量为650 mL 时，克拉维酸合成量达到最高值，当装液量继续增大克拉维酸合成量不增反降。由前面流场分析可知，发酵液中气液传质能力的差异主要是由两种规格摇瓶中气液传质能力差异引起的。2.3 节不同装液量下带挡板摇瓶中的模拟结果也表明，带挡板摇瓶中平均kLa随着装液量增加而增加，当装液量大于650 mL时平均kLa不再增加，因而克拉维酸合成量不再增加。

图10 带档板与不带挡板摇瓶中装液量对克拉维酸发酵的影响Fig. 10 Effect of filling volume in shaking flask with baffle and without baffle on clavulanic acid fermentation

3 结束语

本文提出了一种用于模拟摇瓶在摇床上运动的计算流体力学模型，采用周期性旋转的旋转加速度来模拟摇瓶运动对其内流体运动的驱动力，从而真实地模拟了流体旋转形成的气液交界的自由表面。

利用摇瓶气液两相流的模型，分别在不同摇床转速、装液体积情况下，对摇瓶内形成的流场进行了详细模拟研究，分别考察了以上因素对气液交界面面积大小、比表面积大小、液膜传质系数、剪切力大小、以及平均气液传质能力的影响。结果表明：装液量不变情况下，平均体积气液传质系数随着转速增加而增大，且加装挡板对传质能力提升明显；形成的剪切力也随着转速增加而增加，且带挡板摇瓶的剪切力明显大于不带挡板摇瓶的剪切力，这也解释了带档板摇瓶对克拉维酸种子培养和发酵具有促进作用的原因；进一步考察装液量对流场结构的影响，结果表明转速大小对剪切力的影响远大于装液量的作用，不同装液量下几乎得到相同的剪切力，但是特定转速下存在与之相统一的最优的装液量。

带档板摇瓶中形成的相对高的剪切力及相对充足的供氧条件为克拉维酸发酵提供了更好的流场条件，即供给足量的氧气分子参与克拉维酸分子的生物合成，同时也提供了有利于菌丝分支数提高的剪切环境。本文从流场研究的角度揭示了流场结构对于发酵过程的重要影响，从而提供了一种用于优化摇瓶培养条件的数值模拟方法，该方法可推广到其他发酵产品。