南海海绵Pseudoceratina sp.化学成分的细胞毒协同增效作用及靶点预测

竺婷婷， 袁慧慧， 胡瑾怡， 蓝闽波

（华东理工大学化学与分子工程学院，上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237）

海绵占海洋生物物种的6.7%，其结构独特、活性优异的次级代谢产物[1]是海洋药物先导物的重要来源之一。海绵Pseudoceratinasp.属于Verongida 目Aplysinellidae Bergquist 科[2]，广泛地分布在澳大利亚大堡礁[3]和南澳海域[4]、加勒比海[5]、瓦努阿图海[6]、日本冲绳岛[7]及中国南海海域[8-9]。该属海绵的化学成分以溴代衍生物为代表，显示出多种生物活性，如杀疟原虫活性、广谱的抗菌性、抗肿瘤活性，以及作为小分子抑制剂治疗癌症、纤维化和其他疾病等。

本文目的是以肿瘤细胞毒活性为导向，在我国南海海绵Pseudoceratinasp.中分离和筛选出具有高活性的化学成分。在天然产物的药用活性物质发现过程中，除了基础的细胞试验外，当得到某个结构明确的化合物，可通过综合评估化合物和靶标结构的相关性、活性基团的类型等因素，对靶标进行排序，通过靶标已知的效用筛选与化合物活性作用相关的靶标，分析和预测可能的靶标，最后进行验证，从而大大提高活性物质的筛选效率。文献[10]在利用软件SHAFTS[11]在计算化合物3D 分子相似性的基础上设计开发了Chemmapper Server，在ChEMBL、Drug-Bank、BingDB、PDB、KEGG等数据库中寻找与目标化合物3D 构型相似的小分子的靶标来预测目标化合物的靶标，并根据随机游走算法对目标化合物与靶标结合度进行排序，通过该算法不仅成功地开发了老药新用，而且筛选出了新型冠状病毒的抗病毒药物用于临床治疗[12]。

本文首先对海绵样品进行提取和分离，然后用磺酰罗丹明B（SRB）法对其分离物进行肿瘤细胞毒活性评价，以期得到抗肿瘤活性好的化学成分或组分，并利用Chemmapper Server 对所得的化学成分进行靶点计算，推测可能的作用靶点，为抗肿瘤候选药物的开发提供理论和实践依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和原料

1.1.1 实验仪器 Aglient DD2600 MHz 型核磁共振仪（美国Aglient 公司）；Bruker AVANCEⅢ400 MHz型核磁共振仪（瑞士Bruker 公司）；电喷雾-飞行时间质谱仪（美国Waters 公司）；Aglient 1260 型高效液相色 谱 仪（Aglient 公 司） ； 半 制 备 液 相 色 谱 仪（UV230Ⅱ紫外-可见检测器，P270 高压恒流泵，大连依利特公司）；色谱柱Xcharge C18（4.6 mm×250 mm×5 μm，华谱新创科技有限公司）；色谱柱C18HCE（10 mm×250 mm×10 μm，华谱新创科技有限公司）；色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm，Aglient 公司）；FA2004 型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；柱层析硅胶（烟台江友硅胶开发有限公司）；Sephadex LH-20 型凝胶（Pharmacia 公司）；BB5060 型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；SW-CJ-2FD 型洁净工作台（苏净集团苏州富泰空气技术有限公司）；SpectraMax M2 型多 功 能 酶 标 仪（美 国Molecular Devices 公 司）；LOOYE ZX 98-1 型旋转蒸发仪（上海鲁伊工贸有限公司）；L-550 型台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；LGJ-10D 型冷冻干燥机（北京四环科学仪器有限公司）。

1.1.2 试 剂 DMEM （ Dulbecco's modified eagle medium）高糖培养基、青霉素-链霉素双抗溶液购自HyClone 公司；胎牛血清（FBS）、2.5g/L 胰酶购自Gibco 公司；磷酸盐缓冲液（PBS，自配，氯化钾、氯化钠、十二水合磷酸氢二钠，磷酸二氢钾均为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司）；SRB 购自Sigma-Aldrich 试剂公司；三羟甲基氨易甲烷（Trisbase），分析纯，购于上海凌峰化学试剂有限公司。

1.1.3 原料 海绵实验样品（YT-39）于2011 年8 月采自南海西沙海域，经鉴定为Pseudoceratinasp.，样品保存于海军军医大学药学院海洋药物研究中心。

1.1.4 细胞 细胞株HeLa 人宫颈癌细胞，A549 人肺癌细胞，HepG2 人肝癌细胞，购买自中国科学院细胞库。

1.2 提取与分离

称取海绵样品（湿重）550 g 粉碎，用甲醇与二氯甲烷（体积比为1∶1）混合溶液超声提取5 次（400 mL，30 min）。合并提取液，减压浓缩得到总浸膏24.3 g。总浸膏用300 mL 甲醇的水溶液（甲醇和水的体积比为1∶1）混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次（每次300 mL），乙酸乙酯萃取部位浓缩后得浸膏9.29 g，该浸膏使用硅胶柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯（石油醚与乙酸乙酯体积比分别为10∶1, 5∶1, 3∶1, 1∶1, 1∶3, 1∶5）和乙酸乙酯进行梯度洗脱，根据薄层色谱检测，合并相同组分，得6 个组分 (Fr.1 ～ Fr.6)，其中Fr.4 (251 mg)经半制备液相分离得到化合物1(15.2 mg)，2(43.2 mg)。

1.3 细胞毒活性评价

采用SRB 法[13]测定体外抗肿瘤增殖活性：取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后，用含有10% （体积分数）FBS 的DMEM 高糖培养液制成单细胞悬液，以每毫升2.5 × 104个、每孔200 μL 均匀地接种于96 孔板中。细胞在5%（体积分数）CO2、37 ℃恒温培养箱中培养24 h 贴壁生长后，弃去原上清培养液，加入200 μL 带有不同浓度样品的培养液作为实验组，以不同质量浓度（6.25～100 μg/mL）5-氟尿嘧啶(5-FU)为阳性对照组，以不加样品的空白组为对照组，每组设置3 个复孔。细胞在培养箱培养48 h 后，弃去培养液，每孔加入100 μL 质量浓度为100g/L 的三氯乙酸培养液（不含FBS 的DMEM 高糖培养液），置于4 ℃下固定。1 h 后，弃去培养液，用超纯水清洗5 次，每孔加入100 μL 质量浓度为4g/L 的 SRB 溶液染色。20 min后弃去染色液，用体积分数为1% 冰醋酸溶液洗去多余SRB 溶液。每孔加入150 μL 的10 mmol/L 无缓冲的 Trisbase 溶解SRB，振荡摇匀后，在540 nm 处测定吸光度值（A），同时设置空白对照组（完全培养液）和阳性对照组（5-FU），则细胞增殖抑制率（R）计算公式为：R=（1−ASample/ABlank）×100%，计算结果以平均值±标准偏差表示。采用软件GraphPad Prism 5 进行非线性拟合分析，计算各样品的半数抑制浓度（IC50）。

1.4 化合物靶点及相互作用预测

在 数 据 库chemmapper（网 址 http://lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）中上传化合物1 和2 的分子构型，采用SHAFTS 方法预测与化合物1 和2 的3D 构型相似的化合物的作用靶点，选取BingDB 作为筛选数据库，根据化合物的结构将筛选结构相似度的阈值分别定为1.0、0.8，根据所得靶点的功能和作用机制筛选对细胞增殖、生长、迁移、DNA 修复相关的靶点以及具有相互联系的靶点。

2 结果与讨论

2.1 不同组分及化合物的肿瘤细胞毒活性

各组分及化合物对三种肿瘤细胞的IC50的结果见表1，由表1 可以看出6 个分离组分中对肿瘤细胞A549、HeLa 和HepG2 的细胞毒活性最佳的组分为Fr.6（IC50值 均 不 大 于 15.28 μg/mL） ， 其 次为Fr.4（IC50值均不大于33.16 μg/mL），两个组分的活性均优于或与阳性对照5-FU 相当。液相图上Fr.4 组分只有2 个峰，显示基本无其他杂质，因此在该组分中分离得到2 个化合物（图1），分别鉴定如下：

表1 各组分及化合物对3 种肿瘤细胞的IC50 值Table 1 IC50 values of different fractions and compounds against three different tumour cells

图1 化合物1 和2 的结构式Fig. 1 Structures of compounds 1 and 2

化合物1：淡黄色粉末，ESI-MS 显示有[M+Na]+峰，m/z为694.8，696.8，698.8，700.8，702.8，离子丰度比为1∶4∶6∶4∶1，该化合物有4 个溴原子。1H-NMR(600 MHz, acetonitrile-d6，δH): 7.41 (2H, s, H-3, H-5),7.17 (1H, s, NH), 6.40 (1H, s, H-13), 4.70 (1H, dd,J=7.1, 4,6 Hz, H-7), 4.14 (1H, s, H-17), 3.71 (3H, s, OMe),3.68 (1H, d,J= 18.9 Hz, H-11), 3.46 (1H, ddd,J= 13.8,6.2, 4.6 Hz, H-8), 3.39 (1H, dt,J= 13.5, 6.6 Hz, H-8),3.04 (1H, d,J= 18.3 Hz, H-11);13C-NMR (150 MHz,acetonitrile-d6，δC): 160.5 (C-9), 155.2 (C-10), 150.3 (C-1), 148.9 (C-15), 138.2 (C-4), 132.3 (C-13), 131.0 (C-3,C-5), 122.2 (C-16), 113.6 (C-14), 110.9 (C-2, C-6), 91.4(C-12), 75.0 (C-17), 71.4 (C-7), 60.6 (OMe), 47.3 (C-8),39.9 (C-11)。与文献[14-15] 对照，鉴定化合物1 为hemifistularin-3。

化合物2：黄色粉末，ESI-MS 显示有 [M+Na]+峰，m/z为1098.7，1100.7，1102.7，1104.7，1106.7，1108.7，1110.7，离子丰度比为1∶6∶15∶20∶15∶6∶1，该化合物有6 个溴原子。1H-NMR (600 MHz,acetonitrile-d6，δH): 7.46 (2H, s, H-15 和H-17), 7.27(1H, t,J= 6.0 Hz, NH), 7.13 (1H, t,J= 6.2 Hz, NH),6.40 (1H,s, H-5), 6.39 (1H, s, H-5’), 4.14 (1H, s, H-1),4.13 (1H, s, H-1’), 4.04 (2H, t,J= 6.0 Hz, H-12), 3.71(6H, s, 3-OMe and 3’-OMe), 3.65～3.72 (2H, m, H-7 and H-7’), 3.54 (2H, q,J= 6.6 Hz, H-10), 3.46 (2H, q,J=6.7 Hz, H-20), 3.06 (1H, d,J= 18.4 Hz, H-7 or H-7’),3.03 (1H, d,J= 18.4 Hz, H-7 or H-7’), 2.74～2.79 (2H,m, H-19), 2.06 (2H, p,J= 6.5 Hz, H-11);13C-NMR (150 MHz, acetonitrile-d6，δC): 160.1 (C-9 和C-9’), 155.4 (C-8 or C-8’), 155.3 (C-8 or C-8’), 152.2 (C-13), 148.9 (C-3 和C-3’), 139.7(C-16), 134.3 (C-15 和C-17), 132.4(C-5), 132.3 (C-5 ’), 122.1 和 122.0 (C-2 和C- 2 ’),118.5 (C-14 和C-18), 113.6 (C-4 和C-4 ’), 91.8 和91.7(C-6 和C-6’), 75.0 (C-1 和C-1’), 72.3 (C-12),60.6 (3-OMe 和3’-OMe), 40.8 (C-20), 40.0 (C-7 和C-7’), 37.5 (C-10), 34.7 (C-19), 30.3(C-11)。与 文献[16]对照，鉴定化合物2 为11,19-dideoxyfistularin 3。

细胞毒活性评价表明来源于组分Fr.4 的化合物1 和2 的活性远低于组分的活性（表1），考虑两者可能存在协同增效作用。

2.2 化合物1 和化合物2 复配后的肿瘤细胞毒活性

化合物1 和化合物2 复配后对3 种肿瘤细胞增殖抑制能力均高于化合物1 和化合物2 单独作用的能力（表2），且随着化合物2 比例的增加，复配物对3 种肿瘤细胞增殖抑制活性均先增强后减弱，化合物1 和化合物2 以物质的量之比1∶2 进行配比时，对A549 细胞增殖抑制能力最强，IC50值最低可达到8.71 μmol/L，说明化合物1 和化合物2 之间存在协同作用，且与化合物物质的量之比存在联系。

表2 化合物1 和2 不同配比下对3 种肿瘤细胞的IC50 值Table 2 IC50 values of mixed compounds 1 and 2 against different cell lines

表3 化合物1 和2 不同配比的CI 值Table 3 CI values of mixed compounds 1 and 2

2.3 化合物靶标及相互作用预测

化合物1 及化合物2 的结构相似，预测的靶标有相同但排序有所不同。表4 和表5 分别列举了化合物1 和2 中分数前10 的靶标，其中靶标Vanilloid Receptor 1 (TRPV1, VR1)（Homo sapiens）和Hsf1 protein（Mus musculus）排名均在前三。Vanilloid Receptor 1(TRPV1,VR1)−辣椒素受体1，主要是与抗炎、镇痛、神经[18]相关的作用，在被激活时具有抑制肿瘤增殖的作用[19]；Hsf1 protein 是热休克转录因子(heat shock factors, HSFs)中最主要的一种，由于其在转移的肿瘤组织中呈现出高表达，因而不仅可作为癌症诊断预后指标，还可以直接作为肿瘤治疗靶点[20]。基于多靶标的两种化合物联合使用，可能是其显著抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。

表4 化合物1 预测靶标Table 4 Predicted targets of compound 1

表5 化合物2 预测靶标Table 5 Predicted targets of compound 2

3 讨 论

我国南海海域海绵资源丰富且气候地理条件独特，海绵次级代谢产物的多样性很大程度上源于其生长环境的影响[21]，对我国南海海域的海绵Pseudoceratinasp.次级代谢产物进行抗肿瘤成分研究，发现了潜在的生物医药活性物质。在样品分离过程中，得到的化合物1 和2 对肿瘤细胞抑制活性远低于其上一级组分Fr.4，但是两者对抑制肿瘤细胞生长具有协同增效作用。药物的协同作用受到医药工作者的广泛关注，特别在化疗药的减毒增效[22]和抗耐药性[23]方面的研究较多，但作用机理尚不清晰，而对同一来源的化合物间配伍的协同增效作用则研究更少。

许多生物活性成分会比其相应的萃取物活性弱，原因可能是分离过程中高活性物质的丢失，本研究中从组分Fr.4 分离出化合物1 和2，排除了高活性物质丢失的可能，抗肿瘤活性增强的原因为协同作用机制所致。

协同增效的作用可能是共存成分对活性成分的助溶、助转运等作用从而提高活性成分的效用[17]，然而本研究中化合物1 和2 的抗肿瘤活性均不高，两者之间没有一个核心的高活性成分，由此排除由于化合物的增溶引起的增效作用。

在化合物1 和2 的靶标预测中，根据靶标的功能筛选出与肿瘤细胞增殖、凋亡相关的靶点，比较突出的第一个为Vanilloid Receptor 1，表示化合物可能作为Vanilloid Receptor 1 激动剂激活辣椒素受体而具有抗肿瘤作用。Vanilloid Receptor 1 在HeLa细胞中高表达[24]，且在A549 细胞中比HepG2 细胞表达多[25]，从表2 中可以看出化合物1 和2 联合使用时，对HepG2 细胞株的细胞毒相对最小；第二个为Hsf1蛋白质，表明化合物1 和2 可作为Hsf1 抑制剂，通过抑制Hsf1 使得变性蛋白增多诱发肿瘤细胞发生凋亡。研究表明，Hsf1 抑制剂也可以与其他药物联用以增加药物对癌细胞的杀伤性[20]，这与本研究中两个化合物协同增效作用结果相一致。Hsf1 在恶性肿瘤中基本都是高表达，HepG2[26]、A549[27]、HeLa[28]细胞株经常被用于研究与Hsf1 有关的工作，因此两化合物联合增效作用在3 种细胞株中均有表现。

本文研究了化合物1 和2 的协同作用机制和预测的靶标。未来的工作将通过靶点Hsf1 等验证实验来研究和探索抗肿瘤增效作用机制。本文为海绵提取物的分离、活性研究和应用模式提供新的思路，从而实现更精准地在海洋资源中发现和开发候选药物。