基于萘酸酐的水溶性荧光探针：合成以及在细胞成像中的应用

黄存存， 晏琦帆

（华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237）

荧光成像技术已成为具有高空间分辨率以及实时非侵入式生物过程可视化功能的强大工具，可用于癌细胞的早期诊断和治疗等[1-4]。优异的荧光探针必须满足以下条件：一定的波长范围、荧光发射强度高、生物稳定性好、光稳定性能高、水溶性好、灵敏度高。基于分子识别和特定的有机反应原理，研究开发了多种多样的荧光探针。目前，使用广泛并具有代表性的荧光探针类别包括有机染料[5-6]、生物荧光团[7]、量子dots[8]等，而常被用于构建荧光探针的染料片段包括荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、萘酰亚胺等[9]。其中BODIPY 是受欢迎的一类荧光团[10]，在生物成像中获得了空前的成功，但缺点是其在特定细胞器中的积累会引起聚集淬灭，并且该类分子的水溶性不高。酰亚胺类也是常见的功能性良好的荧光探针片段，尤其是萘酰亚胺，富含具有光物理性质的结构，其吸收和荧光发射光谱位于紫外和荧光的可见光区域[11-12]。另外，萘酰亚胺易于修饰，可通过理性的结构设计轻松地微调各种光物理性质，生物相容性高。

近几年，在荧光探针分子设计方面，水溶性问题越来越受到关注。在生物化学的应用研究中，特别是在细胞成像方面，由于有机溶剂会破坏生物分子的正常功能，因而探针分子良好的水溶性至关重要。目前，水溶性差的小分子探针通常是通过包裹在水溶性基质中进行生物应用，或者在分子设计中通过引入含离子盐侧链或与金属离子配位来提高探针的水溶性，但这增加了制备和分离的难度。Peng 等[13]合成了DCF-MPYM 染料，该染料通过引入一个羧酸基团来增加探针分子的水溶性，其在细胞成像的应用中依然被包装在BSA 基质中以隔绝氧气，防止荧光淬灭。Zhang 等[14]合成了具有聚集诱导发光（AIE）功能的TCM 系列探针，为解决探针的亲水性和亲脂性问题，以及防止探针在进入细胞前聚集，他们添加了三苯基膦基团以增加水溶性，使得探针在细胞应用中有很好的效果。Yang 等[15]开发了具有典型热活化延迟荧光（TADF）和结晶诱导的室温磷光（RTP）特征的新型供体-受体（D-A）荧光探针PXZT，通过PXZT 与锌离子的配位，进而得到水溶性的无荧光分子ZnPXZT1，分子进入细胞后，ZnPXZT1会自动解离释放PXZT，由于PXZT 的疏水性会引发分子聚集进而开启聚集诱导的TADF 发射，其荧光成像效果良好。

本文基于螺芴骨架，通过分子内弱相互作用连接供体和受体，设计合成了D-π-A 体系，骨架采用9,9’-螺二芴这种经典的螺形非共平面分子，中心碳原子通过sp3杂化使得两个芴单元互相垂直，形成十字架结构，提供有效的立体需求。这种刚性结构不仅能够阻止分子之间的团聚，还能有效抑制荧光淬灭。另外探针分子的受体使用的是萘酰亚胺荧光团，其易于修饰和发光性能好的优点受到很多人的青睐，但纯油性分子的水溶性差，应用于细胞成像前需要将探针分子包裹在水溶性良好的基质中，这增加了合成的难度。为了解决探针的水溶性问题，通常的方法是在萘酰亚胺荧光团上引入低聚乙二醇和含离子盐的水溶性侧链。本文提出将萘酰亚胺基团直接水解得到萘酸酐，一方面萘酸酐基团的引入可以使得探针分子在中性和生理酸性溶液中获得足够的水溶性，另一方面该制备方法简单，制得的萘酸酐探针分子可溶于有机相中，有利于探针的分离纯化。细胞成像测试结果表明3 个探针分子染色效果良好，水溶性和生物相容性良好，有望成为癌细胞可视化的强大工具。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

4,4’-二甲氧基二苯胺、9,9-二己基-2,7-二溴芴，购于上海麦克林生化科技公司；氯仿、二氯甲烷、乙酸酐、硝酸、二水合氯化亚锡、乙醚、盐酸、亚硝酸钠、碘化钾、无水乙醇、石油醚、碳酸钾、二氯化钯、四氢呋喃（THF）、氯化钠、甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙酸钾、乙酸、硫酸钠、氯化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇（t-BuOH）、叔丁醇钾（t-BuOK）、甲醇、1,4-二氧六环、四氟硼酸三叔丁基膦（t-Bu3PHBF4）、双联频哪醇硼酸酯、9,9’-螺二芴，均购于上海泰坦科技股份有限公司；[1,1’-双（二苯基膦）二茂铁] 二氯化钯（Pd(dppf)Cl2）、三（二亚苄基丙酮）二钯（Pd2(dba)3）、4-溴-1,8-萘酐、2-乙基己胺，均购于上海阿拉丁试剂股份有限公司；三苯基膦、二甲亚砜，购于上海凌峰化学试剂有限公司。以上所有试剂均为分析纯。

1.2 测试与表征

核磁共振氢谱（1H-NMR）与核磁共振碳谱（13CNMR）：分别采用瑞士布鲁克公司的AVANCE Ш400 型超导傅里叶变换核磁共振波谱仪(400 MHz)和Ascend 600 型 的 核 磁 共 振 波 谱 仪（600 MHz），在室温下测量，以四甲基硅烷（TMS）为内标，以氘代氯仿（CDCl3)、氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）为溶剂。

质 谱（MS ） 采 用 美 国Waters 公 司 生 产的GCTPremier 型电子轰击(EI)-高分辨飞行时间质谱仪，测试范围10～1 500 Da，分辨率≥7 000；ESI-高分辨飞行时间质谱仪，型号为Xevo G2 TOF MS，测试范围50～4 000 Da，分辨率≥20 000；飞行时间质谱仪采用新加坡ABS 公司生产4800plus，测试范围400～500 000 Da。检测样品质量大约是5 mg。

紫外-可见光吸收光谱（UV-Vis）：采用日本SHIMADZU 公司生产的型号为Cary 60 的紫外-可见分光光度计，样品分别溶于二甲基亚砜、去离子水、磷酸盐缓冲液（PBS）、不同pH 缓冲溶液中并稀释成浓度10 μmol/L，然后在比色皿中检测，扫描范围200～800 nm，室温下测定。

荧光发射光谱：采用HORIBA 高灵敏一体式荧光光谱仪，型号FluoroMax-4，激发波长设为紫外-可见光吸收光谱的最大吸收波长，激发和发射狭缝宽度均设为10 nm，电压设定为530 V，样品稀释成浓度为10 μmol/L 后于二甲基亚砜中检测，测定温度室温。荧光量子效率的测定采用参比法，标准化合物为罗丹明6G，室温下测定。

共聚焦成像：采用德国卡尔蔡司生产的Laser Scanning Confocal Microscopy (Nikon A1R and TCS SP8)测试，配制探针浓度为10 μmol/L，孵育Hela 细胞30 min，进行激光扫描测试。

1.3 实验方法

1.3.1 化 合 物2 和 化 合 物5 的 制 备 Buchwald-Harting（碳氮偶联）的一般反应条件，以化合物5 的制备为例。分别称取化合物4[16]（200 mg, 0.27 mmol）和化合物1[16]（200 mg，0.28 mmol）、4,4'-二甲氧基二苯胺（91.8 mg，0.40 mmol）、三（二亚苄基丙酮）二钯（19.8 mg，0.02 mmol）、四氟硼酸三叔丁基膦（23.5 mg，0.08 mmol）和 叔 丁 醇 钾（49.9 mg，0.45 mmol）于Schlenk 管内，抽真空充氮气3 次，加入除氧重蒸过的甲苯10 mL，氮气密封，反应混合物在50 ℃加热30 min，然后120 ℃回流过夜。冷却至室温后，将有机层分别用饱和氯化钠水溶液洗涤3 次、二氯甲烷萃取3 次，然后用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂后，将粗产物通过柱层析纯化，用石油醚和二氯甲烷（体积比9∶1）洗脱，用二氯甲烷和甲醇进行重结晶，得到黄 色 固 体5（120 mg，产 率52%）和 砖 红 色 固体2（149.3 mg，产率63%）。

1.3.2 化合物8 的制备 根据文献[17]方法制备化合物8，所得产物的核磁数据与文献[17] 一致。将4,4’-二甲氧基二苯胺（2.33 mg，10.16 mmol）、9,9-二己基-2,7 二溴芴（1.0 g，2.03 mmol）、叔丁醇钾（360.1 mg，3.25 mmol）、四氟硼酸三叔丁基膦（120.5 mg，0.41 mmol）、三（二亚苄基丙酮）二钯（99 mg，0.10 mmol）一起加入到烘干的Schlenk 管中，抽真空充氮气3 次，加入重蒸过的甲苯50 mL，80 ℃下加热搅拌22 h。然后冷却至室温，分别用乙酸乙酯萃取3 次、饱和氯化钠溶液洗涤3 次，取有机相用无水Na2SO4干燥，减压旋蒸除去溶剂得粗产物。通过柱层析进一步纯化，石油醚和乙酸乙酯（体积比9∶1）作为展开剂，得到黄色固体7-溴-9,9-二己基-N,N-双（4-甲氧基苯基）-9H 芴-2-胺（701.2 mg，产率54%）。

分别称取7-溴-9,9-二己基-N,N-双（4-甲氧基苯基）-9H 芴-2-胺（500 mg，0.78 mmol）、双联频哪醇硼酸酯（297.4 mg，1.17 mmol）、[1,1’-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯（44 mg，0.114 mmol）和醋酸钾（114.6 mg，1.17 mmol），加入到烘干的100 mL Schlenk 烧瓶中，抽真空充氮气3 次，加入10 mL 重蒸的1,4-二氧六环，用氮气密封，将反应在70 ℃下搅拌回流12 h。冷却至室温后，用乙酸乙酯萃取3 次，用饱和氯化钠溶液洗涤3 次，有机相用硫酸钠干燥，并通过旋转蒸发除去溶剂，留下黑色油状物。将该油状物通过柱层析纯化，并使用乙酸乙酯与石油醚的体积比逐渐增加的展开剂进行淋洗，然后旋干得到黄色油状物，乙醇重结晶，得到黄色的固体7（299.8 mg，产率56%）。

分别称取化合物7（278.5 mg，0.41 mmol），化合物4（200 mg，0.27 mmol）、四（三苯基膦）钯（5.8 mg，0.01 mmol） 、 碳 酸 钾（ 91.2 mg， 0.66 mmol）于Schlenk 管中，抽真空充氮气3 次，向反应器中分别加入四氢呋喃10 mL 和去离子水1 mL，用氮气密封，将反应在65 ℃下回流过夜。冷却至室温后，将有机层用盐水洗涤3 次、二氯甲烷萃取3 次，然后用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂后，将粗产物通过柱层析进一步纯化，并使用乙酸乙酯与石油醚的体积比逐渐增加的展开剂进行淋洗，得到黄色固体化合物8（147 mg，产率46%）。

1.3.3 探针分子的合成 参考文献[18]方法并进一步改进。水解反应的一般步骤是：在叔丁醇（10 mL）中加入萘酰亚胺衍生物（0.80 mmol），室温下搅拌20 min，再加入氢氧化钾（817 mg，16.0 mmol），在氮气氛围下回流加热3 h，冷却至室温后，加入乙酸30 mL。室温下再搅拌5 h，析出固体，过滤，柱层析纯化，以石油醚和二氯甲烷（体积比2∶1）作为展开剂得到固体，在二氯甲烷和甲醇中重结晶，得到相应的3 个探针分子3、6、9。基于萘酸酐的这3 个探针分子易溶解于有机溶剂，并可以在有机溶剂中分离纯化，大大减少了普通水溶性荧光探针分离纯化的难度，为设计合成水溶性荧光探针提供了新的思路。酸酐取代基由于对水溶液或生理条件下pH 的响应，其在中性或弱碱性条件下可转化为带电荷的羧酸根基团，从而使探针分子从油溶性转化为水溶性，方便探针分子在生物成像方面的应用。

2 结果与讨论

2.1 探针的结构表征

通过Buchwald-Harting 反应（碳氮偶联）/Suzuki偶联反应和水解反应制备探针3、6、9（图1），其结构经由核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱等谱学技术表征。

图1 化合物3、6、9 的合成路线Fig. 1 Synthetic routes of compounds 3、6 and 9

化合物2（红色固体，54%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.54 (d, 1H,J= 7.2 Hz), 8.49 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.09 (d, 1H,J= 8.8 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz),7.73 (d, 2H,J= 7.2 Hz), 7.68 (d, 1H,J= 8.4 Hz),7.56～7.52 (m, 2H), 7.46 (dd, 1H,J= 7.8, 1.0 Hz), 7.33(t, 2H,J= 7.4 Hz), 7.16 (t, 2H,J= 7.4 Hz), 6.90 (d, 7H,J= 8.4 Hz), 6.75 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 6.69 (d, 4H,J= 8.8 Hz), 6.47 (d, 1H,J= 1.6 Hz), 4.15～4.05 (m, 2H), 3.74 (s,6H), 1.94～1.89 (m, 1H), 1.37～1.27 (m, 8H), 0.91 (t, 3H,J= 7.4 Hz), 0.85 (t, 3H,J= 6.8 Hz)；13C-NMR (151 MHz, CDCl3,δ) : 164.9, 164.7, 155.8, 150.5, 149.7,149.3, 148.8, 147.1, 142.4, 141.9, 141.0, 136.9, 134.0,132.8, 131.3, 130.9, 130.1, 129.9, 128.9, 127.94, 127.91,127.9, 126.8, 126.2, 125.5, 124.1, 123.0, 121.5, 121.2,121.0, 120.4, 119.2, 116.8, 114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1,31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3, 10.9；MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。

化合物3（红色固体，83%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.56 (dd, 1H,J= 7.2, 0.4 Hz), 8.51 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.20 (dd, 1H,J= 8.6, 0.6 Hz), 7.86 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.74 (d, 2H,J= 7.6 Hz), 7.69 (d, 1H,J= 8.4 Hz), 7.61～7.57 (m, 2H), 7.45 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz),7.34 (td, 2H,J= 7.5, 0.7 Hz), 7.17 (td, 2H,J= 7.6, 0.8 Hz), 6.93～6.89 (m, 7H), 6.75 (d, 1H,J= 0.8 Hz),6.71～6.67 (m, 4H), 6.47 (d, 1H,J= 2.0 Hz), 3.74 (s,6H)；13C- NMR (151 MHz, CDCl3,δ)： 161.0, 160.8,155.9, 150.6, 149.9, 149.5, 148.8, 148.6, 142.9, 141.9,140.9, 136.0, 134.4, 133.7, 133.4, 133.1, 131.1, 130.4,129.8, 128.4, 128.01, 128.0, 127.2, 126.3, 125.4, 124.0,121.08, 121.06, 120.4, 119.4, 119.0, 117.3, 116.6, 114.7,66.1, 55.6；MS (EI) calcd. for C51H33NO5：739.2 (m/z),found 739.2 (m/z)。

化合物5（黄色固体，46%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.59 (dd, 1H,J= 7.4, 0.6 Hz), 8.56 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 8.14 (dd, 1H,J= 8.4, 0.8 Hz), 7.92 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.68 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.64 (t, 1H,J= 8.0 Hz), 7.59 (dd, 2H,J= 8.0, 1.6 Hz), 7.48 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz), 7.39 (td, 1H,J= 7.5,0.9 Hz), 7.31 (td, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 7.19 (td, 1H,J=7.5, 0.9 Hz), 7.04 (td, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 7.93 (d, 1H,J= 1.2 Hz), 6.90～6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H,J= 7.6 Hz),6.67 (dd, 4H,J= 6.8, 2.4 Hz), 6.54 (d, 1H,J= 2.0 Hz),4.18～4.08 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 1.98～1.92 (m, 1H),1.41～1.29 (m, 8H), 0.93 (t, 3H,J= 7.4 Hz), 0.87 (t, 3H,J= 7.0 Hz);13C-NMR (151 MHz, CDCl3,δ): 164.9,164.7, 155.8, 150.5, 149.7, 149.3, 148.8, 147.1, 142.4,141.9, 141.0, 136.9, 134.0, 132.8, 131.3, 130.9, 130.1,129.9, 128.9, 127.94, 127.91, 127.9, 126.8, 126.2, 125.5,124.0, 123.0, 121.5, 121.2, 121.0, 120.4, 119.2, 116.8,114.7, 66.2, 55.6, 44.3, 38.1, 31.0, 28.9, 24.3, 23.3, 14.3,10.9；MS (EI) calcd. for C59H50N2O4: 850.4 (m/z), found 850.4 (m/z)。

化合物6（亮 黄 色固体，73%）：1H-NMR (400 MHz, CDCl3,δ): 8.61 (dd, 1H,J= 7.6, 0.8 Hz), 8.58 (d,1H,J= 7.6 Hz), 8.25 (dd, 1H,J= 8.4, 0.8 Hz),7.94 (d,1H,J= 8.0 Hz), 7.85 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.69～7.58 (m,5H), 7.47 (dd, 1H,J= 8.0, 1.6 Hz),7.40 (td, 1H,J= 7.4,0.8 Hz),7.31 (td, 1H,J= 7.4, 0.6 Hz), 7.20 (td, 1H,J=7.6, 0.8 Hz), 7.05 (td, 1H,J= 7.4, 0.8 Hz), 6.94 (d, 1H,J= 1.6 Hz), 6.91～6.85 (m, 6H), 6.73 (d, 1H,J= 7.2 Hz),6.69～6.65 (m, 4H), 6.53 (d, 1H,J= 2.0 Hz), 3,73 (s,6H);13C- NMR (151 MHz, CDCl3,δ) ： 161.0, 160.7,155.7, 150.2, 149.6, 149.5, 148.8, 148.8, 148.2, 142.8,141.9, 141.2, 140.8, 137.4, 135.2, 134.2, 133.5, 133.13,131.10, 130.5, 129.7, 128.7, 128.4, 128.1, 127.4, 126.9,125.9, 125.4, 124.4, 123.9, 121.8, 120.8, 120.7, 120.5,119.5, 119.1, 117.6, 117.1, 114.7, 66.2, 55.7；MS (EI)calcd. for C51H33NO5: 739.2 (m/z), found 739.2 (m/z)。

化合物8（黄色固体，52%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.52 (d, 2H,J= 6.8 Hz), 8.10 (d, 1H,J= 8.4 Hz), 8.04 (d, 1H,J= 6.4 Hz), 7.97 (d, 1H,J= 6.0 Hz),7.89 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.84 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.67(d, 1H,J= 8.4 Hz), 7.59 (d, 1H,J= 6.4 Hz), 7.56～7.51(m, 2H), 7.48～7.37 (m, 5H), 7.34～7.11(m, 4H),7.05～7.04 (m, 4H), 6.95～6.87(m, 4H), 6.86～6.80 (m,5H), 4.17～4.03 (m, 2H), 3.79 (s, 6H), 1.92～1.77 (m, 5H),1.37～1.26 (m, 8H), 1.10～1.00 (m, 12H), 0.92～0.85 (m,6H), 0.76～0.75 (m, 6H), 0.64～0.60 (m, 4H)；13C-NMR(101 MHz, CDCl3,δ): 164.8, 164.7, 155.6, 152.4, 151.3,149.9, 149.4, 149.1, 149.0, 148.4, 146.8, 142.4, 141.9,141.7, 141.3, 141.0, 140.8, 138.6, 138.4, 134.2, 132.6,131.3, 130.9, 130.1, 130.0, 128.9, 128.7, 128.2, 128.0,127.4, 126.9, 126.0, 124.6, 124.1, 123.0, 122.6, 121.8,121.2, 120.9, 120.6, 120.3, 119.0, 116.7, 114.8, 66.4,55.7, 55.2, 44.4, 40.4, 38.1, 31.6, 31.0, 29.8, 28.9, 24.3,23.9, 23.2, 22.7, 14.3, 14.2, 10.9；MS (ESI) calcd. for C84H82N2O4: 1 182.6 [M]+, found 1 183.6[M+H+]。

化合物9（黄色固体，79%）：1H-NMR (400 MHz,CDCl3,δ): 8.55 (d, 1H,J= 4.0 Hz), 8.53 (d, 1H,J= 4.8 Hz), 8.21 (d, 1H,J= 8.8 Hz), 8.05 (d, 1H,J= 8.0 Hz),7.97 (d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.89 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.85(d, 1H,J= 7.6 Hz), 7.69～7.64 (m, 2H), 7.58～7.53 (m,2H), 7.50～7.32 (m, 6H), 7.23 (t, 1H,J= 7.8 Hz), 7.15 (t,1H,J= 7.8 Hz), 7.11～7.03 (m, 5H), 6.95～6.88 (m, 4H),6.84～6.80 (m, 5H), 3.80 (s, 6H), 1.84～1.77 (m, 4H),1.10～1.00 (m, 12H), 0.77～0.73 (m, 6H), 0.65～0.60 (m,4H);13C- NMR (101 MHz, CDCl3,δ): 161.0, 160.7,155.7, 152.4, 151.4, 150.2, 149.4, 149.0, 148.8, 148.6,148.4, 142.9, 141.9, 141.7, 141.1, 141.0, 140.9, 138.5,137.6, 134.3, 134.1, 133.5, 133.1, 131.0, 130.4, 130.0,128.9, 128.5, 128.32, 128.3, 128.0, 127.4, 127.3, 126.1,125.8, 124.7, 124.1, 122.5, 121.2, 120.9, 120.71, 120.7,120.5, 120.4, 120.3, 119.0, 117.6, 116.7, 114.8, 66.4,55.7, 55.2, 40.4, 31.6, 29.8, 23.9, 22.7, 14.2；MS (Maldi Tof)calcd. for C76H65NO5: 1 071.5 (m/z), found 1 071.5 (m/z)。

2.2 光物理性能表征

2.2.1 紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱 首先比较探针分子3、6、9 在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱，如图2（a）所示。可见探针分子3 在351 nm处的强谱带归因于其π-π 共轭骨架的吸收，400～500 nm 处较长的宽吸收带是由于电子给体的4,4'-二甲氧基二苯氨基单元和电子受体的萘酸酐单元之间的分子内电荷转移（ICT）跃迁的结果。基于分子内电荷转移类型的跃迁，探针的荧光发射性质对溶剂极性非常敏感[16]。因此对于探针分子6，采取本共轭（HOMO-conjugation）的方式将电子给体和电子受体进行键连，其吸收峰值明显蓝移至356 nm，这一吸收带应该是由4,4'-二甲氧基二苯氨基螺芴的π-π*跃迁引起。因此，在探针6 的4,4'-二甲氧基二苯氨基和螺芴片段中，插入一个芴的结构，能明显使吸收峰发生红移。探针分子9 的吸收峰值红移至382 nm，更加有利于细胞成像中的光激发（激发波长404 nm）。探针分子3、6、9 在二甲基亚砜稀溶液中的荧光发射光谱如图2（b）所示，最大发射峰依次为3 （519 nm），6（440 nm）和9（504 nm），峰值的变化趋势与3 个探针分子的紫外-可见吸收光谱相吻合。进一步测定并计算了探针分子3、6、9 的荧光量子产率（Φ），分别是0.51，0.07，0.23（表1）。探针分子9 是探针分子6 的改进，可见其发射峰值的位置和荧光量子产率明显增加，有利于探针分子在细胞成像中的应用。

表1 化合物3、6、9 在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的表征数据Table 1 UV-vis absorption and fluorescence emission characterization data of compounds 3, 6, 9 in dimethyl sulfoxide

图2 化合物3、6、9 在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱（a）和荧光发射光谱（b）Fig. 2 UV-vis absorption spectra (a) and fluorescence emission spectra (b) of compounds 3, 6, 9 in dimethyl sulfoxide

2.2.2 探针的水溶性测试 由于酸酐基团与碱作用可转化为羧酸根，因此酸酐基团为探针分子在生理条件下的水溶性提供了重要的作用。为了探索探针分子形态与水溶液酸碱性之间的关系。以探针分子3 为例，测试了其在不同pH 下的紫外-可见吸收光谱（图3(a)）。随着溶液碱性的不断增加，光谱最大吸收波长处的吸收强度随之增强。将365 nm 处的吸光度和472 nm 处的吸光度比值（A365/A472）对pH 值作图（图3(b)），可以看出，比值随pH 增大而单调上升，表明分子中的酸酐官能团逐渐与溶液中氢氧根负离子作用，转变为羧酸/羧酸根结构和双羧酸根结构。由于这种转变探针分子带上了电荷，其在中性或生理酸性水溶液中的溶解能力得到了提高。生理条件（PBS 缓冲溶液，pH 约为7.4）下，溶液呈中性或偏弱碱性，此时酸酐基团已经向羧酸根进行转化，使得这类探针分子变得水溶，并可用于生理条件下的细胞成像。

为了进一步了解探针分子3、6、9 在水中和生理缓冲溶液（pH 约为7.4）中的吸收情况，考察了他们的紫外-可见吸收图谱（归一化处理），结果分别如图3（c）和（d）所示。与图2 探针分子3、6、9 在二甲基亚砜中的吸收曲线进行比较，可见3 个探针分子的吸收光谱没有明显的变化，这说明其水溶性皆良好，但3 个探针分子皆有最大吸收波长和起峰红移现象，这是因为与二甲基亚砜相比，溶剂极性增大，探针分子的激发态受影响，从而使其能量强度降低。比较图3（c）和3（d）可以看出，探针分子6 的水溶性随着溶液碱性的增加而明显增加，表明酸酐基团对探针分子水溶性的提高起到了重要作用。

图3 （a）化合物3 在不同pH 下的紫外-可见吸收曲线；（b）化合物3 在不同pH 下A365/A472 的比值；化合物3、6、9 在水中（c）和在PBS 缓冲溶液中（d）的紫外-可见吸收光谱Fig. 3 (a) UV-Vis absorption spectra of compound 3 at different pH; (b)A365 / A472 ratio at different pH of compound 3; Normalized UV-Vis absorption spectra of compound 3, 6, 9 in water (c) and in PBS buffer solution (d)

2.2.3 共聚焦成像 为了探索基于3 个探针分子的可视化癌细胞的可行性，进行了Hela 细胞成像实验。将Hela 细胞与3、6、9 3 个探针（10 μmol/L）在37 ℃、CO2/空气（体积比5∶95）的条件下孵育30 min，随后用PBS 溶液将细胞冲洗3 次，进行共聚焦成像实验，其中激发波长λex= 404 nm。如图4 所示，3 个探针皆成功染色，其中探针3 和9 孵育的Hela 细胞在绿色通道中显示了较强的荧光，探针6 孵育的细胞显示了相对较弱的荧光，3 个探针的成像均背景信号干扰小，信噪比高。探针9 的荧光强度和成像效果高于探针6，这说明结构的改进达到了良好的效果。3 个探针中，探针3 的成像效果最好，荧光强度最高，这是因为其共轭性良好，荧光发射波长最长。总之，细胞成像结果表明设计合成的3 个探针均可以作为靶向癌细胞成像的有前途的工具。

图4 化合物3、6、9 对Hela 细胞的共聚焦成像Fig. 4 Confocal imaging of Hela cells with compound 3, 6 and 9

3 结论与展望

本文成功设计并合成了以螺芴为骨架基于萘酸酐基团的3 个水溶性良好的探针分子3，6，9，这是通过简单有效的化学修饰手段，将普通有机油溶性染料转变成了水溶性良好的探针，为设计合成水溶性荧光探针提供了新思路。通过一系列光物理测试，发现随着溶剂碱性的增加，分子中的酸酐官能团转变为羧酸/羧酸根结构和双羧酸根结构，进一步提高了探针分子在中性或生理酸性下水溶液中溶解的能力，使探针具有了良好的水溶性以利于细胞成像。共聚焦细胞成像中，3 个探针分子皆成功染色，背景信号干扰小，信噪比高，其中探针分子3 的成像效果最好，荧光强度最高，可作为靶向癌细胞成像的有前途的工具。本文的结果对于设计合成基于萘酸酐基团水溶性荧光探针提供了重要的参考意义。