粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇提取方法的验证与优化
2021-10-25郝全英王丽娟郭建君刘芳芳
郝全英 ，王丽娟，郭建君，刘芳芳 ，杨 柯
（1.山西粮食质量监测中心，山西 晋中 030600；2.北京东孚久恒仪器技术有限公司，北京 100037）
脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （deoxynivalenol,DON）是一种主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的真菌毒素，存在于小麦、大麦、燕麦、黑麦和玉米等谷类作物中，在全球污染普遍，对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首，是各国重点控制的真菌毒素之一。禾谷镰刀菌在适宜的气温和湿度等条件下繁殖并产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇，脱氧雪腐镰刀菌烯醇对动物和人均有一定的毒性。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理后，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在3类致癌清单中。
本文以小麦、玉米中DON对其提取方法为例进行验证与优化，主要参考标准包括：GB/T 2761-2011《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》、GB 5009.111-2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法、GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》。按照GB 5009.111-2016中给定的方法进行优化，结合免疫亲和柱的操作手册对GB 5009.111-2016中提取DON的方法进行验证，使回收率得到提高。本方法净化效果好、准确度高、平行度好，可以满足粮食中DON的限量检测要求。
1 材料与方法
1.1 仪器设备
保水式盘式粉碎磨，LM3303，瑞典波通仪器公司；安捷伦1260 Infinity高效液相色谱仪，包括安捷伦紫外检测器，自动进样器，柱温箱，四元梯度泵;数显调速摇床，YC-96，常州市天境实验仪器厂;ScoutSE电子天平，YP402N,奥豪斯仪器有限公司；台式高速离心机，TG18-WS，湖南湘立科学仪器有限公司;高通量全自动固相萃取仪，Fotector Plus-60，美国睿科仪器有限公司;水浴氮吹仪，NDK-12W,上海皓庄仪器有限公司；250 mL具塞三角瓶；实验室清洗消毒机，G7883,德国美诺。
1.2 试剂
色谱级甲醇、乙腈，迪马科技；超纯水，由沃特浦纯水机生产，四川沃特尔水处理设备有限公司。
真菌毒素标准品：脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液(GBW(E)100304)质量浓度为 100 μg/mL。
标准工作液；质量浓度分别为100 ng/mL、200ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5000 ng/mL。
提取液：超纯水。
免疫亲和柱：Evergreen TREA呕吐毒素免疫亲和柱3 mL。
1.3 色谱条件
色谱柱：安捷伦-C18,4.6 mm×250 mm(5 μm)；
流动性：20%的甲醇；
流速：1.0 mL/min；
检测器：紫外检测器，波长218 nm；
进样体积：30 μL；
柱温：35℃。
1.4 优化条件的确定
1.4.1 分样不均匀对结果的影响
以小麦样品中DON限量点的100%加标，即含量为1 000 μg/kg。对同一个颗粒样品进行2次与4次分样的比对，然后粉碎。按照GB 5009.111-2016的提取方法进行测定，得到DON的不均匀性非常大，分样不均匀做的试验的误差较大，分样次数越多双试验误差越小。所以做样之前要对样品进行充分地混合，否则误差大，结果不准确。结果见表1。
1.4.2 称样量的大小对结果的影响
以小麦样品中DON限量点的100%加标，即含量为1 000 μg/kg。对同一个样品进行称样量的不同进行比对，按照GB 5009.111-2016的提取方法进行测定，分别称取 5.00 g、12.50 g、25.00 g三种梯度进行测定，试验结论表明：称样量越大双实验的误差越小，结果越准确。结果见表2。
表2 不同称样量各水平的含量
1.4.3 相同振荡频率不同的振荡时间、相同振荡时间不同的振荡频率对结果的影响
以小麦样品中DON限量点的100%加标，即含量为1 000 μg/kg。对同一个样品进行相同频率不同时间、相同时间不同频率进行比对，按照GB 5009.111-2016的提取方法进行测定。由表3和表4两组数据可得出DON提取方法最佳的振荡频率为200 r/min，振荡时间为20 min。
表3 振荡频率200 r/min时不同的时间对结果的影响
表4 振荡频率230 r/min不同的时间对结果的影响
1.4.4 氮吹温度对结果的影响
以小麦样品中DON限量点的100%加标，即含量为1 000 μg/kg。对同一个样品进行测定，按照GB 5009.111-2016的提取方法进行测定，最后一步一个样品用50℃的氮吹，另一个样品用60℃氮吹。得出结论：用50℃氮吹所用时间为20 min左右，用60℃氮吹所用时间为10 min左右，通过表5可知60℃与50℃回收率基本一致，60℃可以节省时间，也可以节省成本。故60℃为最佳氮吹温度。
表5 不同的氮吹温度对结果的影响
1.4.5 不同的定容溶液对结果的影响
以小麦样品中DON限量点的100%加标，即含量为1 000 μg/kg。对同一个样品进行测定，按照GB 5009.111-2016的提取方法进行测定，最后一步一个样品用20%的甲醇定容，另一个样品用10%的乙腈定容。得出结论：不同的定容溶液对结果影响不是太大，用两个溶液都是可以的，为了跟流动相一致，选用20%的甲醇最佳。结果见表6。
表6 不同的定容溶液对结果的影响
1.4.6 优化条件结论
小麦DON测定试验中，首先分样必须均匀，称样量要大于25.00 g,振荡频率为200 r/min振荡时间为20 min,最后用60℃氮气吹干，用20%的甲醇定容为最终的试验条件。
1.5 提取与净化
1.5.1 提取方法
原始样品经研磨粉碎、过筛，使其粒径小于0.5～1 mm，混匀备用。
分别准确称取25.00 g(精确到0.01 g)磨碎的试样于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇8000，加超纯水100 mL，混匀，置于摇床中200r/min振荡20 min。以6 000 r/min下离心10 min，收集滤液于干净的容器中。
1.5.2 净化方法
取2 mL上述上清液到固相萃取仪，操作步骤如表7：
表7 Fotector Plus脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和净化方法
最后，在60℃下用氮气吹干洗脱液，加入1mL20%甲醇定容，混匀后利用高效液相色谱仪进行测定。
2 结果与分析
2.1 标准色谱图和线性范围
在上述色谱条件下，DON的标准品色谱图如图1所示。
图1 DON的标准品色谱图
将配制好的标准工作液做线性回归分析，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标得到DON线性方程和相关系数，Y=0.03843263X+0.2240615，R2=0.99996，线性范围 100～5 000 ng/mL，DON 标准曲线如图2所示。
图2 DON标准曲线图
2.2 样品的加标回收测定
2.2.1 样品加标色谱图
本试验以小麦DON限量为基准，分别向3组样品中添加DON标准溶液，其添加水平分别是500μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg， 每组样品做 3个平行试验。小麦空白基质及加标样品色谱图分别见图 3、图 4、图 5、图 6。
图3 小麦空白基质色谱图
图4 小麦DON的加标量为500 μg/kg色谱图
图5 小麦DON的加标量为1 000 μg/kg色谱图
图6 小麦DON的加标量为2 000 μg/kg色谱图
2.2.2 回收率试验
向小麦基质中添加DON标准溶液,使其含量为500 μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg，三组平行加标回收率结果见表8：
按照此方法做了玉米、大豆、玉米粉及小麦粉的DON加标回收试验，DON的回收率（%）见表9。
3 结论
本文主要对粮食中DON的提取和净化方法进行了比对、研究。在GB 5009.111-2016中DON提取净化的基础上结合试验中的具体操作进行了优化和改进，最终按照DON的优化改进提取方法得到了最佳的回收率。本方法效果好、可靠、准确度和精密度高，能够运用于粮食中DON的检测工作，满足分析要求，有一定的参考应用价值。
