葡萄籽提取物对柑橘果实的保鲜效果研究

尹 佳,王玉瑶,谢富忠,刘得鹏,李继锋

(吉林化工学院 生物与食品工程学院,吉林 吉林 132022)

在葡萄废弃物中，葡萄籽的生物活性物质最丰富.葡萄籽提取物(grape seed extract,GSE)是一种天然的保健食品，含有丰富的多酚，例如儿茶素、表儿茶素、原花青素和单体黄烷醇[1].实验研究表明GSE具有很好的抑菌活性和抗氧化性能[2-3].柑橘是我国第一大水果，果实营养丰富，口感优良,截止到2019年国内柑橘产量已突破4 000万吨.柑橘采摘后，失重较为明显，导致其新鲜度大幅度下降，又因微生物感染等外在因素，在鲜销过程中极易发生病害，每年鲜果损失率达25%～30%.本文就不同工艺制备的GSE的抗氧化活性进行比较，使用抗氧化活性强的GSE对柑橘保险应用效果等进行研究，旨在开发植物源的天然保鲜剂，开拓保鲜技术领域，充分利用食品工业残渣，减少环境污染，提高柑橘品质.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

供试水果：市售柑橘(皇帝贡柑，产地广东省四会市)，选择大小均匀一致，无机械损伤和病虫害的果实进行处理；葡萄籽(品种赤珠霞)提取物：实验室自制；聚乙烯塑料薄膜袋(义乌市智峰塑料制品有限公司，规格8×12 cm,厚度7丝).

JA-503分析电子天平：天津精拓仪器设备有限公司；DDL-5M离心机：济南博鑫生物技术有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅：上海一恒仪器设备有限公司；PSH-25型酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PR-5旋转蒸发器：南通普瑞科技仪器有限公司；UV-1800紫外分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；FD-2A真空冷冻干燥机：上海继普仪器制造有限公司；GY-4型果实硬度计：山东食安生物科技有限公司；1260 Infinity II高效液相色谱系统：美国安捷伦公司.

1.2 实验过程

1.2.1 GSE的制备方法[4]

1.2.2 不同方法制备的GSE抗氧化活性的测定

(1) GSE清除DPPH·自由基清除能力测定[5-6]

配制浓度为0.1 mol·L-1的DPPH·乙醇溶液与不同浓度梯度的GSE溶液；分别量取2 mL的GSE溶液与2 mL的DPPH·乙醇溶液，混合均匀，之后在避光处静置30 min；在517 nm波长条件下，测量混合溶液的吸光值，并计算DPPH·自由基清除率.加样溶液与测定项目见表1.每组样品溶液平行测定3次，取平均值.

表1 DPPH·自由基清除实验加样表

DPPH·自由基清除率(Y)按公式计算：Y=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0为未加入样品溶液时所测溶液的吸光度；Ai为加入样品溶液后所测溶液的吸光度；Aj为未加DPPH·溶液的样品溶液的吸光度.

(2) GSE对铁离子还原能力的测定[7]

取不同浓度GSE，加入浓度0.2 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 6.6)3.5 mL和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合均匀，在50 ℃水浴中反应25 min.再分别加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，摇匀，4 000 r/min离心10 min，然后取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL、0.1%的三氯化铁溶液0.5 mL，混匀,静置10 min，在波长700 nm条件下测定其吸光度值.

1.2.3 GSE主要成分分析

参照李伟楠[8]的研究方法通过液相色谱-质谱连用技术,测定GSE中主要成分的含量.

1.2.4 GSE对柑橘防腐保鲜作用的研究

将GSE用蒸馏水稀释至质量分数分别为0.01%、0.1%和1%，将果实(剔除残次果)分别置于不同浓度提取液中浸泡3 min，清水对照，待自然风干后，用聚乙烯塑料薄膜袋单果包装，选用普通库房(室温15～20 ℃，相对湿度65%～80%)贮存.常温贮存期间每隔5 d测定1次样品的失重率、可滴定酸含量、腐烂率、Vc含量、感官评价指标、丙二醛含量和硬度等数据，评价GSE对柑橘保鲜的效果.

(1)失重率测定[9]：每隔5 d从各组中挑选15个称重，结果取其平均值.

失重率计算公式为：W=(M1-M2)/M1×100%,

式中：W为柑橘样品失重率，%；M1为柑橘样品初始的重量，g；M2为测试当天柑橘样品的重量，g.

(2)硬度测定：使用GY-4型果实硬度计3.5 mm探头进行穿刺测量，1个样品取3个位点测定硬度，并取其平均值[10].

(3)感官评价指标：由通过专业感官评价培训的20名学生组成感官评定小组，以色泽、褶皱、风味和腐烂情况为指标，分别对果实的品质进行评定，评定标准见表2.

表2 感官评定标准

(4)腐烂率：每5 d观察1次果实，当柑橘表面出现水渍状淡褐色病斑且伴有白色菌丝体则记为腐烂果实，记录其数量[11].

腐烂率%=(腐烂个数/测定总数)×100

(5)可滴定酸含量：采用NaOH滴定法测定[12].

(6)Vc含量：使用紫外分光光度法测定[13].

Vc含量=(C×V总×V待测总×100)/(V1×W总×1000)

式中：C为根据标准曲线方程计算得到的VC浓度，μg·mL-1；V1为测吸光度时吸取样品溶液的体积，mL；V总为吸取果实定容总体积，mL；V待测总为待测样品总体积，mL；W总为柑橘质量，g； 100为100 g柑橘果实.

(7)丙二醛含量：采用硫代巴比妥酸法[14].称取果实1.0 g，加入5.0 mL 100 g·L-1三氯乙酸溶液，研磨匀浆后，于4 ℃、8 000 r·min-1离心20 min.吸取2.0 mL上清液，加入2.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混合后沸水浴20 min，冷却离心，分别测定上清液在450、532、600 nm波长处的吸光度，重复3次取平均值.

(8)可溶性固形物(SSC)含量：取混匀后的果肉，榨取果汁，双层纱布过滤，折光仪测定榨出果汁中的SSC含量，重复3次，取平均值.

1.3 数据分析

用Excel 2016对试验所得数据进行统计分析和绘图，用SPSS 13.0进行方差分析,通过Duncan法多重比较判断数据差异显著性，P>0.05表示差异显著.所有试验重复3次.

2 结果与讨论

2.1 GSE的抗氧化活性

将3种方法制备的GSE样品稀释为不同的质量浓度，进行清除DPPH·自由基能力和对铁离子还原能力的测定，结果如图1和图2所示.GSE的DPPH·自由基清除率在实验浓度范围内均呈增长的趋势，并且超声辅助回流法的DPPH·自由基清除率相对于单一的回流法与超声法均有显著的提高(P<0.05).分析原因主要是超声波产生的机械力对葡萄籽细胞有破壁作用，使葡萄籽的有效成分在加压条件和回流作用下更易分离析出，从而增加GSE的提取率，最终提高了GSE的抗氧化活性.GSE对铁离子还原能力均随质量浓度的增加呈现增强的趋势,尤其浓度为0.8 mg·mL-1时还原能力最高.采用超声辅助回流法制备的GSE还原能力最大，即抗氧化活性更强[15]，所以GSE具有良好的体外抗氧化活性.

样品浓度/(mg·mL-1)图1 GSE对DPPH·自由基的清除能力

样品浓度/(mg·mL-1)图2 GSE对铁离子的还原能力

2.2 GSE主要成分分析

GSE主要成分包括低聚原花青素、原花青素B2、儿茶素、表儿茶素等多酚类化合物,主要成分的含量见表3.

表3 GSE的主要成分

2.3 GSE对柑橘防腐保鲜作用的结果

2.3.1 柑橘果实失重率与硬度

如图3所示，在常温贮藏过程中，柑橘果实失重率呈现逐渐上升的趋势，这是由于果实长时间暴露在空气中，仍然进行呼吸和代谢作用,不断消耗自身水分导致果实重量下降.与对照组相比，GSE处理组果实的失重率始终保持相对较低的水平；贮藏第40 d，1%浓度的GSE处理组果实失重率比对照组低27.26%，这两组果实失重率之间差异显著(P<0.05).GSE处理降低了贮藏期柑橘果实的失重率.

贮藏时间/d图3 GSE对贮存期间柑橘失重率的影响

一般而言，硬度能够直接反映出果实的成熟度和腐烂程度.

贮藏时间/d图4 GSE对贮存期间柑橘硬度的影响

如图4所示，在常温贮藏过程中，柑橘果实硬度逐渐下降；1% GSE处理组明显延缓了果实贮藏期间硬度的下降；贮藏第40 d，对照组果实的硬度下降到1.20 kg·cm-2，而0.01% GSE处理组的硬度比对照组高出13.33%，这两组果实硬度之间差异不显著(P>0.05).

2.3.2 果实感官评价与腐烂率

如图5所示，在常温贮藏过程中，柑橘果实感官评价呈现下降的趋势.贮藏第10 d开始，对照组样品品质开始显著下降(P<0.05)，样品表面已经出现明显收缩，色泽暗淡，而经GSE处理的果实的感官评价指标始终保持相对较高的水平；贮藏第40 d时，1% GSE处理组的感官评价指标比对照组高出46.38%(P<0.05).GSE处理延缓了贮藏期柑橘果实感官品质的下降.

贮藏时间/d图5 GSE对贮存期间柑橘感官评价指标的影响

如图6所示，GSE处理组均有效地抑制了柑橘果实的腐烂率.贮藏第40 d时，对照组腐烂率达到69.20%，而1%GSE处理组的果实腐烂率比对照组低47.25%(P<0.05).所以，GSE处理降低了常温贮藏期柑橘果实的腐烂率.

贮藏时间/d图6 GSE对贮存期间柑橘腐烂率的影响

2.3.3 果实可滴定酸含量与VC含量

果蔬中含有多种有机酸是植物品质的重要检测指标，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性酸的含量是影响果实风味品质的重要因素[16].如图7所示，在常温贮藏过程中，柑橘果实可滴定酸(TA)含量呈现逐渐下降的趋势.在实验前期和后期，与对照组相比，GSE处理组的果实TA含量始终保持相对较高的水平；贮藏第40 d时，0.1%GSE处理组比对照组高出28.95%，这两组果实TA含量之间差异显著(P<0.05).GSE处理减缓果实在贮藏期间风味品质的变化.

贮藏时间/d图7 GSE对贮存期间柑橘可滴定酸含量的影响

Vc是一种具有还原性的物质，在果蔬贮存过程中对其起保护作用.Vc可以清除果蔬体内的自由基，降低自由基对果蔬机体的伤害[17].通常果蔬在采后常温贮存时，Vc作为呼吸底物消耗导致含量下降，从而影响果蔬的品质.如图8所示，在常温贮存期各处理组Vc的含量均呈现下降的趋势.贮藏第40 d时，对照组的Vc含量下降到8.38 mg·100 g-1，0.1%GSE处理组比对照组高出56.56%(P<0.05).GSE处理降低果实在贮藏期间Vc的损失.

贮藏时间/d图8 GSE对贮存期间柑橘Vc含量的影响

2.3.4 果实的丙二醛含量与SSC含量的变化

植物衰老或是在外环境下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生丙二醛(MDA).所以通过测定MDA的含量可以掌握膜脂过氧化的程度，间接反映细胞膜系统的受损程度和植物衰老程度[18].如图9所示，样品的丙二醛含量在常温贮存期呈现上升的趋势，贮藏第40 d时，0.1% GSE处理组果实中丙二醛含量为0.087 3 moL·g-1·Fw)，比对照组低出22.26%(P<0.05).GSE处理对柑橘具有延缓后熟衰老作用.

贮藏时间/d图9 GSE对贮存期间柑橘丙二醛含量的影响

柑橘的可溶性固形物(SSC)含量越高，说明柑橘成熟度越高；反之，柑橘成熟度越低.如图10所示，贮藏至第5 d时，对照组的SSC含量明显升高，达17.4%；贮藏至第40 d时，对照组果实的SSC含量均达12.17%，而1% GSE组的SSC含量为10.31%，低于对照组15.28%.表明GSE处理能有效延缓SSC含量的上升速度，增强柑橘的耐贮藏性.

贮藏时间/d图10 GSE对贮存期间柑橘SSC含量的影响

3 结 论

柑橘采后常温贮存条件下应用GSE处理进行保鲜，不仅没有对柑橘品质产生不良影响，而且能在一定程度上降低柑橘腐烂率和失重率，延缓Vc含量和可溶性酸含量的下降，进而延缓柑橘的后熟衰老,增强柑橘的耐贮藏性.因此GSE处理能改善柑橘的贮藏品质，增强柑橘的保鲜性，延长货架期.GSE对减少酿酒饮料加工副产物葡萄籽的浪费和降低环境污染具有重要的实践意义，有望开发成为相对安全、环保、无公害的果实保鲜剂.