二甲双胍对成牙骨质细胞成骨作用的研究*

刘 畅 徐婉秋 许晓航 王秀梅

牙骨质在1835 年被发现且描述[1]，是包绕牙根表面的一层骨样物质。作为牙体的重要组成部分，牙骨质主要有两项功能，一是把牙周组织和牙体组织结合在一起，二是可以修复牙根表面的损伤。牙骨质的修复能力在临床上具有重要意义，主要表现在它不但能修复由于过度咬合力等因素造成的根面小范围骨吸收和牙骨质折裂，还能在根管治疗、根尖切除术后新生牙骨质并覆盖根尖孔，重新建立牙体与牙周组织的联系。另外，正畸牙移动时有约20%的牙齿会出现牙根吸收[2]，表现为根面凹陷，牙根变短，牙齿的松动甚至脱落，此时牙骨质的修复就显得尤为重要。成牙骨质细胞(cementoblasts，CB)附着在牙根表面可形成前期牙骨质，进而矿化为成熟牙骨质，在牙根修复中起到重要作用[3]。2000 年，D’Errico 等成功培养出了永生化的成牙骨质细胞OCCM-30[4]，现已作为成熟的成牙骨质细胞系开展相关研究。

二甲双胍(metformin，MF) 作为降糖药物对于糖尿病的作用已经得到肯定，Cortizo 首次研究了MF 在成骨细胞系分化中的作用，显示一定浓度的MF 在24 小时内呈剂量依赖性促进UMR106和MC3T3 细胞的增殖、分化和矿化[5]。随着大量研究的深入，其在成骨方面的作用得到了广泛的关注和证实[6]。CB 和成骨细胞具有很高相似性，但目前关于MF 作用于成牙骨质细胞的研究尚未见报道。因此，本实验用一定浓度的MF 作用于对数生长期的OCCM-30 细胞，检测MF 对OCCM-30细胞增殖、分化和矿化能力的影响，为临床牙骨质修复再生提供实验依据。

1.材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 OCCM-30(原吉林大学口腔医学院孙宏晨教授团队友情赠予)，二甲双胍(索来宝公司)、F12 培养基(Gibco 公司，美国)、双抗(碧云天生物技术有限公司)、MTS(sigma 公司，美国)、ALP 检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)、茜素红(sigma 公司，美国)、实时荧光定量PCR 试剂盒(Roche 公司，瑞士)、BSP 和Runx2抗体(武汉三鹰生物有限公司)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、细胞培养恒温箱(Thermo Scientific 公司，美国)、倒置显微镜(Nikon 公司，日本)、LightCycler Ⓡ480 荧光定量PCR 仪(Roche 公司，瑞士)、垂直板电泳及转膜系统(Bio-Rad 公司，美国)、电泳仪(Amersham Biosciences 公司，美国)、GraphPad Prism 5.0 软件、Imaga J 软件、Image Pro Plus 6.0 软件。

1.2 方法

1.2.1 成牙骨质细胞的培养 采用含10%胎牛血清的F12 培养基培养OCCM-30 细胞[7]，在细胞贴壁生长至80%时于无菌超净台上传代，用PBS清洗细胞两次，适量预热胰酶消化细胞，显微镜镜下见细胞变圆脱壁时用含血清培养基终止消化。900r/ min 离心5min，弃上层液体，取新鲜培养基吹散细胞制成均匀细胞悬液，1∶2 传代，隔天换液。选择处于对数生长期状态良好的细胞用于实验。

1.2.2 细胞增殖能力的测定 将对数生长期的细胞制成均匀的细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为50000 个/ ml，种于96 孔板，每孔100ul 细胞悬液。待细胞贴壁后进行分组，换用含有不同MF 药物浓度(0、25、50、100、200、400、800、1600μmol/ L)的培养基继续培养，每组设置5 个复孔。放入培养箱中分别培养24、48、72 小时后，每孔加入20μl MTS，放入培养箱中孵育4 小时，酶标仪在490nm 波长处检测各孔吸光度值并记录。

1.2.3 实时荧光定量PCR 法(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)检测细胞中Runx2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和BSP (bone sialoprotein，BSP)mRNA 的表达水平

将OCCM-30 细胞以每孔1×105个接种到六孔板，待细胞贴壁后进行分组，实验组分别用含MF浓度为200、400μmol/ L 的完全培养基培养，对照组不加药。在分组后的12、24、48 小时分别提取细胞总RNA，应用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，应用Real-time PCR 试剂盒进行PCR 反应。目的基因为Runx2 和BSP，内参基因为β-actin，其引物序列[7]参照表1。利用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

表1 目的基因和β-actin 基因的引物序列

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测细胞中Runx2 和BSP 蛋白的表达水平 将贴壁的OCCM-30 细胞分为用含200μmol/ L MF 培养基培养的实验组，和不含MF 的对照组。分组培养12、24、48 小时后提取细胞总蛋白，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞1 小时。4℃，14000r/ min 离心40 分钟,取上清液采用BCA 法检测蛋白浓度。加入适量蛋白上样缓冲液，100℃，8 分钟，煮沸变性。配置SDS-PAGE 凝胶，上样，进行电泳及转膜。将PVDF 膜放入5%脱脂奶粉中封闭1 小时，TBS 洗膜。I 抗4℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜，室温下避光孵育II 抗1 小时，洗膜后将膜置于曝光机内显影。采用Imaga J 软件对各条带进行灰度值分析，以GAPDH 为内参，以条带灰度值比值表示蛋白的表达水平。

1.2.5 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性测定取生长状态良好的OCCM-30 细胞以每孔1×105个接种到六孔板，贴壁后分为对照组和200μmol/ L 的MF 实验组。分别在第3、7天收集细胞沉淀于EP 管中，每管加入1ml Triton X-100 裂解液，40 分钟后，按ALP 试剂盒进行操作，同时用BCA 法进行蛋白浓度测定。细胞中ALP 活性(金氏单位/ gprot)=(测定OD 值－空白OD 值)÷(标准OD 值－空白OD 值)×酚标准品浓度(0.02mg/ ml)÷待测样本蛋白浓度(gprot/ ml)。

1.2.6 茜素红染色法检测细胞外矿化结节形成细胞以每孔1×105个接种于六孔板，待贴壁后分别加入含0、200μmol/ L MF 的矿化诱导液，隔天换液。培养21 天后，4%多聚甲醛室温固定细胞30 分钟，1%茜素红染液染色，镜下观察矿化结节形成情况。应用Image Pro Plus 6.0 软件分析矿化结节面积百分率。

1.3 统计学分析 实验重复3 次，实验数据用平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析，组间两两比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 MF 对OCCM-30 细胞增殖能力的影响MTS 法测定MF 对OCCM-30 细胞增殖作用的影响，结果如图1 所示，200μmol/ L MF 组在24、48、72 小时均对OCCM-30 细胞的增殖具有促进作用，且在48、72 小时作用明显，差异具有统计学意义(*P＜0.05，**P＜0.01)。400μmol/ L MF组在48、72 小时亦对OCCM-30 细胞存在促进作用(*P ＜0.05)。在MF 作用细胞72 小时时，1600μmol/ L MF 对OCCM-30 细胞的增殖有抑制作用(*P＜0.05)。说明MF 对OCCM-30 细胞的促增殖作用可能依赖于剂量和时间，高浓度MF作用细胞一定时间后会对其产生抑制作用。其中200μmol/ L MF 对细胞增殖的促进效应最明显，我们推测体外培养OCCM-30 细胞的最佳MF 浓度为200μmol/ L，因此后续多选用对细胞活力最有益的200μmol/ L MF 进行进一步实验。

图1 不同浓度MF 对CB 增殖能力的影响

2.2 MF 对OCCM-30 细胞中Runx2 和BSP mRNA 表达水平的影响 与对照组相比，12、24、48 小时时200μmol/ L、400μmol/ L 的MF 组BSP和Runx2 mRNA 的表达水平均明显升高，具有统计学差异(*P＜0.05，**P＜0.01)。其中Runx2 mRNA 在200μmol/ L MF 作用下升高更明显，而BSP mRNA 则在400μmol/ L MF 作用下升高更明显(见图2)。

图2 MF 对Runx2 和BSP mRNA 表达水平的影响

2.3 MF 对OCCM-30 细胞中Runx2 和BSP蛋白表达的影响 WB 法检测结果显示：与对照组比较，200μmol/ L MF 作用12、24、48 小时后，Runx2 和BSP 蛋白表达水平均有提高，且MF 对BSP 蛋白表达的影响更大。分析各目的条带与GAPDH 灰度值的比值，进行统计学分析，结果显示：200μmol/ L MF 作用12、24 小时对BSP 蛋白的表达具有促进作用，差异具有统计学意义(*P＜0.05，**P＜0.01)，在24 小时对BSP 蛋白表达的影响最显著(t=5.508，P=0.0053)；作用细胞24、48 小时对Runx2 蛋白表达增加的影响亦具有统计学差异(*P＜0.05)(见图3)。

图3 MF 对Runx2 和BSP 蛋白表达水平的影响

2.4 MF 对OCCM-30 细胞中ALP 活性的影响 用200μmol/ L MF 处理OCCM-30 细胞3 天，结果显示ALP 的活性高于对照组，差异具有统计学意义(t=4.456，P=0.0112)。7 天200μmol/ L MF 组的ALP 活性较对照组略有升高，差异无统计学意义(见图4)。提示MF 可以在早期诱导OCCM-30 细胞的成骨分化。

图4 MF 对ALP 活性的影响

2.5 MF 对OCCM-30 细胞矿化结节形成的影响 含200μmol/ L MF 的矿化诱导液和不含MF的矿化诱导液分别作用OCCM-30 细胞21 天后，实验组和对照组均可见矿化结节。采用茜素红染液染色后，镜下可明显见到红色矿化结节和钙盐沉积。与对照组相比，MF 组矿化结节体积较大，钙盐沉积更明显(见图5)。Image Pro Plus 6.0 软件分析矿化结节面积百分比，显示200μmol/ L MF 组细胞外矿化结节面积百分比更大，差异有统计学意义(t=4.748，P=0.0090)(见图6)。

图5 MF 作用于OCCM-30 细胞21 天后的茜素红染色结果

图6 MF 诱导OCCM-30 细胞21 天后各组细胞外矿化结节面积百分比

3.讨论

牙骨质在解剖学和功能上分别归于牙体组织和牙周组织，是将牙体与牙周组织联系在一起的重要结构。在生理情况下，牙骨质一直在不断的新生而较少有吸收；而在病理情况下，如年轻恒牙牙髓炎[8]、侵袭性牙周炎的患儿常伴有牙骨质发育异常导致的牙根缩窄、弯曲等现象[9]。成牙骨质细胞作为参与牙根发育的重要功能细胞，分泌形成牙骨质，在牙根的吸收和修复过程中起到重要的作用。目前，众多研究者将材料学与细胞生物学相结合，如ε-氨基己酸/ 壳聚糖颗粒[10]和氧化锌纳米颗粒[7]等材料的引入为提高成牙骨质的矿化能力，促进牙骨质再生提供了新方法。MF 是临床上的一线降糖药物，其治疗糖尿病的效果已经得到充分肯定。近年来，其在骨损伤修复方面的作用和机制也得到了广泛的关注和证实。有研究显示，MF 可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶而增加细胞AMP/ ATP 的比值，导致胰岛素和溶酶体的急剧活化，使细胞内葡萄糖水平降低，从而促进成骨细胞的增殖和分化[6]。MF 通过调控sirt6 和oct4 的表达可以促进小鼠前成骨细胞的增殖和分化[11]。在高血糖条件下，MF可促进牙种植体周围骨的形成，提高种植体早期骨结合率[12]。此外，MF 还可通过BMP-4/ Smad/Runx2 信号通路提高骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能，促进骨形成[13]。

目前，关于MF 作用于CB 的研究尚未见报道，MF 能否促进相关口腔疾病导致的牙骨质吸收破坏的修复尚不清楚。本研究在细胞水平和分子水平上对不同浓度的二甲双胍对CB 增殖、分化及矿化的能力的影响进行初步探究。体外细胞功能学实验表明，适宜浓度的MF 对OCCM-30 细胞具有一定的促增殖效应，其主要依赖于剂量和时间。200μmol/ L 和400μmol/ L 二甲双胍在处理细胞1～3 天时均对细胞增殖具有促进作用，这与以往用二甲双胍处理成骨细胞系的研究结果相似。本研究中高浓度1600μmol/ L MF 作用3 天时会对细胞的增殖产生抑制作用，前两天则抑制作用不明显，分析原因可能为高浓度二甲双胍会对OCCM-30 细胞周期逐渐产生抑制作用，促进了细胞的凋亡。

Runx2 是成骨细胞的特异性转录因子，在成骨细胞分化和骨形成方面起到重要的作用[14]。ALP是成骨细胞早期分化的指标，与骨组织重建和骨基质矿化关系密切[15]。ALP 的表达代表着骨形成的情况，表明细胞分化的开始，其活性的高低能反应成骨细胞分化成熟的程度[16]。本实验提示一定浓度的MF 可促进成牙骨质细胞早期矿化。由于本实验采用F12 完全培养基培养细胞，故推断MF 促进矿化的作用可不依赖于矿化诱导液。矿化结节的形成是成骨细胞分化的最后阶段，本实验采用茜素红染色法评价最终的骨形成情况。200μmol/ L MF培养OCCM-30 细胞21 天后，镜下显示MF 组与对照组均有明显的矿化结节形成，而MF 组的矿化结节更大，钙盐沉积也更加广泛。说明MF 对成牙骨质细胞外的基质形成和矿化具有促进作用。

BSP 在牙骨质的发育初期高表达，具有诱导成牙骨质细胞分化和粘附的功能[17]。研究表明，在牙骨质的矿化过程中，BSP 参与了矿化中心的形成并可诱导牙骨质样结构的矿化[18]。有学者在成牙骨质细胞形成细胞结节后持续培养，发现在细胞结节形成矿化结节的过程中，BSP 持续高表达[19]。本研究结果显示，用200μmol/ L MF 处理OCCM-30一定时间可在基因和蛋白层面促进Runx2 和BSP的表达。

本研究结果使MF 可以促进骨形成的作用得到了进一步验证。此外，本实验首次提出一定浓度范围内的MF 能促进CB 的增殖、分化及矿化，提高CB 的成骨能力，为进一步探究MF 促进牙骨质再生的作用机制奠定了理论基础，为各种原因导致的牙根吸收、牙骨质破坏的修复提供新的用药思路和实验依据。