推拿对慢性应激大鼠抑郁行为的影响及其机制*

杜津莉， 李 建， 孙 鹏， 王宇澄， 张洁瑛

(天津中医药大学第一附属医院， 天津 300381)

世界卫生组织报告显示，全球抑郁患者达3.5亿人，每年自杀死亡的患者人数高达100万人[1]。有研究表明，抑郁症的发病机制与应激密切相关[2-3]。海马和前额叶皮质等脑区长期慢性应激会造成关脑区的神经元细胞受损和调亡，对认知、感觉和运动等方面具有多级协调作用，是调控情绪的高级中枢。因此改善海马和前额叶皮质等脑区的神经元损伤同时促进其再生是治疗抑郁症的有效措施[4-5]。

脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)对脑神经元细胞具有抗损伤和促生长作用，该因子受细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-related kinases，ERK)调节[3]。推拿是一种很有效的放松身体的手段，对烦躁、焦虑、抑郁等情绪有良好的缓解作用[6]。抑郁症发病机制的研究还处于探索之中，需要全面考虑，多层次综合研巧，明确ERK-BDNF的生理病理变化规律和意义，可更好的阐述抑郁的病理机制，对抑郁的治疗也有积极促进的作用。因此，本实验选择从ERK信号通路这个点出发，研究推拿是否能激活慢性应激抑郁模型大鼠海马和前额叶皮质等脑组织的ERK信号通路，促进BDNF表达，发挥抗抑郁的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康大鼠40只(北京华阜康动物实验中心)，6～8周龄，体重为230～250 g。饲养动物环境：室温20～25℃，相对湿度40%～60%，饮水瓶每日更换，明暗环境各12 h交替。

1.2 主要仪器与试剂

旷场、高架十字迷宫及水迷宫的视频采集及分析系统。ERK、P-ERK抗体(批号：4695S、4377S，Cell Signaling Technology公司)，BDNF抗体、GAPDH抗体(批号：ab46176、ab181602，美国Abcame公司)，盐酸氟西汀分散片(礼来苏州制药有限公司，批号：4126A)，BDNF试剂盒(ZK-R3364，ZIKER子科生物)。

1.3 模型制备

大鼠适应性饲养一周后，制备慢性轻度不可预见性的应激大鼠模型[1-2]。大鼠慢性应激反应造模21 d，每种应激刺激不连续使用3次，包括：断食24 h；断水24 h；束缚4～6 h；振荡30 min；夹尾30 min；冰水游泳(4～6℃，3～6 min)，夜间光照24 h。大鼠随机分为4组(n=10)：空白对照组，造模21 d的模型组、氟西汀组(阳性药)、推拿组。空白组和模型组不做处理，氟西汀用蒸馏水配成0.2 ml/kg混悬液，以1.54 mg/kg灌胃给药。缚成模大鼠于自制固定装置，定位大鼠膀胱经重要穴位：肺俞、心俞、膈俞、脾俞、肾俞、关元俞、申脉(图1)，依标准按揉施推拿术；固定时间、每天 10 min，间隔2 min(共4次)，14 d连续施术。为确保实验的准确性，推拿手法由一人完成。

Fig. 1 Bladder meridian acupoint map of rats

1.4 标本采集和处理

行为学评定结束后，5%水合氯醛麻醉，取大鼠脑前额叶皮质组织于液氮中冻存。

1.5 行为学评定方法

1.5.1 旷场试验[7]场箱内径长、宽、高为75 cm、75 cm、40 cm，外周带有视频录像和照明的隔音箱、大鼠放置于场箱中央区域，录像系统能自动记录大鼠在5 min内的活动路程。

1.5.2 糖水消耗实验[8-9]大鼠禁水23 h，鼠笼上同时放置事先称重的两瓶水分别为普通饮用水和1%蔗糖水。四组大鼠饮用1 h后，撤掉、称重。

1.5.3 水迷宫实验 水迷宫为圆形水池，直径100 cm，深50 cm，水温(24±2)℃。水而覆一层塑料泡沫屑。池壁上4个等距离点分水池为4个象限，在第三象限中央放置平台，平台无色透明，直径6 cm，高28 cm。平台没于水而下2 cm，水池周围参照物保持不变。试验包括：(1)定位航行试验(place navigation test)：实验历时7 d。将大鼠从入水面向池壁置入水槽中，记录大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。每只大鼠每人从4个不同象限入水点入水进行训练各1次，取其平均值为其每人逃避潜伏期。训练中，若大鼠在60 s内找到平台，让其于平台上站立10 s；若未找到，用棒将其引上平台，并让其站立10 s，潜伏期限记为60 s。将大鼠从平台上拿下来休息60 s之后，再按序由下一入水点入水进行下一次实验。(2)空间探索试验第8天撤去平台，将大鼠从第二象限入水点放入水槽，记录60 s内其在平台象限的滞留时间。

1.6 指标检测

采用体质量测量，Western blot法检测前额叶皮质ERK、P-ERK、BDNF蛋白表达情况。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠的体质量检测结果

与空白组比较，抑郁模型组大鼠体质量下降，有统计学意义(P<0.01，表1)；与模型组比较，推拿组和氟西汀组组大鼠的体质量均显著增加(P<0.01)。

2.2 旷场实验结果

推拿14 d后，进行旷场实验显示，与空白组比较，抑郁模型组大鼠水平运动总路程减少，有统计学差异(P<0.01)；与模型组比较，推拿组和氟西汀组大鼠的水平运动总路程均显著增加(P<0.01, 表2)。

Tab. 2 Total distance of open field experiment inrats of each group(mm, n=10)

2.3 水迷宫实验结果

推拿14 d后，进行水迷宫实验显示(表3)，与空白组比，抑郁模型组穿越平台次数、目标象限路程及目标象限停留时间均显著减少(P<0.01)；与模型组比，推拿组和氟西汀组大鼠穿越平台的次数、目标象限路程及目标象限停留时间均有所增加(P< 0.05，P<0.01)。

Tab. 3 Experimental results of water maze space exploration inrats of each n=10)

2.4 大鼠糖水消耗量

实验前1 d，各组大鼠之间的糖水消耗量没有显著性差异(P>0.05)。实验35 d后，与空白组相比，模型组糖水消耗显著降低(P<0.01)。与模型组相比，推拿组、氟西汀组糖水消耗量显著上升(P< 0.01，表4)。

Tab. 4 Sugar water consumption of rats before and after the experiment(g, n=10)

2.5 Western blot法检测前额叶皮质ERK、P-ERK、BDNF蛋白表达情况

推拿14 d后，大鼠前额叶皮质ERK、P-ERK、BDNF蛋白检测结果，如图2和表5所示，空白组、模型组、西氟汀组、推拿组大鼠前额叶皮质ERK蛋白表达无明显差异。与空白组比较，抑郁模型组大鼠前额叶皮质P-ERK和BDNF蛋白表达显著下降(P<0.01)；与模型组比较，推拿组和阳性药组前额叶皮质P-ERK和BDNF蛋白表达显著上升(P< 0.05，P<0.01)。

Fig. 2 Expressions of ERK, p-ERK and BDNF in prefrontal cortex

Tab. 5 Results of Western blot analysis of p-ERK / ERK protein in rats of each n=10)

3 讨论

抑郁症属中医“郁证”范畴，主要因劳神过度、忧思郁结、气机郁滞所致。治法以解郁、调神为主[10]。推拿可使患者放松而精神内守，治疗过程中，医生与患者沟通，引导情绪，专一病所，使其经气畅达；另外推拿治疗后，热气流通全身，肌腠疏解。穴位推拿以经络俞穴为基础，通过神经反射和经络系统调节患者神经及分泌系统，使其功能平衡，达到大脑放松、心理释放、肌肉松弛的效果[11]。本文推拿所取的各穴位作用如下[11-12]：肺俞可解表宣肺、肃降肺气；心俞穴可养血宁心、理气止痛、通络宽胸、改善睡眠；膈俞：养血和营、理气宽胸、活血通脉；关元俞：外散小腹内部之热；胃俞穴可理气和胃、化湿消滞、益气和中；肾俞穴可补肾益气；申脉：补阳益气，疏导水湿，治疗头痛、癫狂痫证、失眠等症。本实验以手法作用于膀胱经第一侧线背腧穴[12]，通一身之阳气，调畅气机、调节五脏六腑功能，达到平衡阴阳、交心肾、养心血、安神志的作用。

ERK信号通路是经典的MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号转导途径，遵循三级酶促级联反应。活化的ERK迅速进入核内，磷酸化核糖体S6激酶(SRK)，进而促进多种转录因子和核蛋白的表达。ERK的磷酸化是该通路重要的枢纽，促进BDNF等相关基因的转录和表达，从而调节细胞的增殖、分化、调亡、生存。临床试验[13-14]和动物实验[15-17]显示抑郁症的发生发展与ERK信号通路关系密切。人患有抑郁症后，其脑额叶皮质组织中ERK信号通路受到抑制，相关因子得不到激活从而表达下降，导致患者欣快感下降，同时焦虑情绪增加。其原因是MEK1(ERK1/2上游激酶)的基因表达下调，会导致患者血清中的BDNF水平下降，病情加重，生活质量下降[18-20]。BDNF对脑神经元细胞具有抗损伤和促生长的作用，在与情感调节有着关的海马、前额叶皮质等脑区中含量较高。推拿具有悠久的历史和系统的中医理论体系，是一种放松身体的有效手段。抑郁症在病理上表现出焦虑，情绪低落，思维迟缓，意志活动减退等症状。有例可证，将中医按摩应用到抑郁症患者身上将有效缓解相关抑郁症状，调理气血，舒缓情志，放松患者的身体。本研究针对细胞信号转导通路方面提出推拿抗抑郁机制研究假设，验证推拿是否能通过调节ERK的磷酸化水平化及BDNF的蛋白表达发挥抗抑郁作用。

额叶是大脑活动的高级执行中枢，位于前中央沟前部，占大脑皮层的40%左右，主要包括：运动皮质、前运动皮质、前额叶皮质(PFC)和额叶底內侧部分。PFC与多个感觉加工区都存在着往返的纤维联系，同杏仁核、伏隅核等核团一起构成奖赏中枢调节情绪，尤其对获取快乐的能力有重要作用。PFC与注意力、长时短时记忆、认知功能障碍以及多种神经心理疾病有关，当其受损时，会导致焦虑、抑郁、言语障碍等疾病，为多位学者研究抑郁症模型的重点部位[21]。因此，本研究选择前额叶皮质部位进行研究。

抑郁症是一种由多因素引起的以情绪低落为典型表现的情感障碍，是危害全人类的常见病、多发病，已成为全球性的主要精神卫生问题。慢性应激作用虽小但持久，慢性或持续的应激使中枢系统损伤，可能导致能力和适应水平的逐渐减低。慢性应激是生活事件和抑郁症之间的一个重要中介因素，无论是身体还是心理上的慢性应激都会使人或动物患上抑郁症，而慢性应激则会加重抑郁情绪和情绪障碍的患者的症状。抑郁症的生物学涉及体内多个系统，致病因素非常复杂。推拿的抗抑郁作用是多靶点、多层次的共同结果，可对神经一免疫一内分泌系统综合调节，但是推拿治疗抑郁症的作用机制多局限于单方面的独立研究，缺乏系统性与综合性的研究。因此，需要全方位，更深层次的角度去研究治疗途径：将传统的中医治疗方法与西医西药的方法结合起来，在提高临床疗效的基础上，阐明机理进而获得新的医学认识的一种途径。已有多位学者对推拿针刺等中医治疗手法结合西药去治疗抑郁症患者，获得很成功的研究成果[22-24]。本研究以大鼠为研究对象，建立抑郁模型。在接受21d慢性温和应激刺激后，治疗14d，模型组大鼠糖水消耗量减少，表明慢性应激破坏了大鼠的奖赏机制，反应敏感水平下降，出现快感缺失、兴趣减少的症状。同时伴有体质量、水平穿越格数、目标象限路程、目标象限停留时间显著减少，表现出大鼠探充行为和自主活动减弱，与抑郁症患者伴有的食欲、体重减少以及思维迟缓、意志活动减退等精神运动迟滞症状相似，以上大鼠行为均证明了大鼠处于抑郁状态。氟西汀为临床治疗抑郁症的常用药，治疗效果显著，本研究通过推拿组与氟西汀组药效学比较，证明推拿可有效治疗慢性应激产生的抑郁大鼠。根据对人的推拿手法推演到大鼠相对应的经络进行推拿，观察抑郁大鼠的体脂量，水迷宫、糖水消耗、矿场等实验，确认推拿手法的有效，进一步通过Western Blot方法研究其效应机制。本研究发现，造模成功的大鼠体质量明显下降、探究行为明显减少；同时前额叶皮质组织中ERK蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表达显著下降。而经过推拿干预的大鼠体质量和探究行为明显增加，说明推拿可改善大鼠的抑郁情绪及活动强度；推拿组ERK蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表达显著增加，说明通过推拿大鼠膀胱经可促进前额叶皮质ERK蛋白磷酸化，进而促进脑组织中的效应蛋白BDNF的表达，改善大鼠的抑郁症状，为推拿用于临床治疗抑郁症患者提供理论依据。