BmNPV对家蚕海藻糖酶活性及其基因表达的影响

唐芬芬，杨伟克，谢 昆，袁盛勇，沈登荣，何 超，张 睿，刘 娜

（1. 红河学院 生物科学与农学学院，云南 蒙自 661101；2. 云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101）

海藻糖酶（Trehalase，EC3.2.1.28）广泛存在于细菌、真菌和动植物体内。海藻糖酶是昆虫机体唯一能够水解海藻糖的酶类，它可专一地将海藻糖水解为葡萄糖，参与机体的能量代谢过程，维持正常的生理活动[1⁃2]。利用海藻糖酶抑制剂Trehazolin 抑制东亚飞蝗机体海藻糖酶活性，幼虫活动能力减弱，取食减少，糖代谢进程受阻[3⁃4]。在低温或短光照条件下，海藻糖酶活性的增强能促进家蚕滞育激素的释放，进而诱导雌性蛾子卵巢产滞育卵[5]。海藻糖酶在昆虫滞育过程受到保幼激素和蜕皮激素协同调控，并参与滞育期机体的物质能量代谢过程[5⁃6]。注射蜕皮激素20E 能诱导甜菜夜蛾海藻糖酶基因SeTre1的表达，增强海藻糖酶活性[6]。喂食20E能提高竹长蠢幼虫中肠海藻糖酶活性和促进其编码基因的表达[7]。研究表明，昆虫海藻糖酶在杀虫剂的解毒代谢过程以及昆虫抗逆性的适应过程中也发挥了一定的作用[8⁃9]。三唑磷农药处理褐飞虱幼虫，机体海藻糖酶基因Tre1显著上调表达，海藻糖酶活性呈现先逐渐增强后急剧减弱的趋势，暗示海藻糖参与了褐飞虱抵抗三唑磷农药的解毒过程[10]。嗜眠摇蚊幼虫通过降低海藻糖酶活性，减少海藻糖的水解，使海藻糖大量累积，用于应对干旱等不良环境的胁迫[11]。

海藻糖酶作为家蚕机体极其重要的一类水解酶，在蜕皮变态过程中通过调控表皮几丁质的合成和降解，进而影响蚕体的生长发育[12]。海藻糖酶直接影响蚕体海藻糖的代谢进程，其活性大小与蚕体的生理状况及抗逆性密切相关[13]。一般情况下，蚕体海藻糖酶活性强，机体糖代谢旺盛，幼虫的生长发育齐一，蜕皮变态进程顺利，自身抗性也随着增强。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染在家蚕饲育过程中较常见，主要诱发家蚕血液型脓病。该病传染性强，危害严重，每年给蚕农带来严重的经济损失[14]。关于家蚕抗BmNPV的研究[15⁃16]虽然已有许多报道，但BmNPV 与宿主的相互作用机制至今仍未完全解析清楚[17⁃18]。海藻糖酶作为机体抗逆性的一类糖水解酶，不仅能将海藻糖水解为小分子的葡萄糖，为蚕体提供能量物质，而且在机体抗逆过程发挥了重要功能。然而，关于海藻糖酶在家蚕抵御BmNPV 侵染过程中的生理作用及其分子机制的研究鲜见报道。鉴于此，以具有经济价值的绢丝昆虫家蚕为研究对象，探究其在遭受BmNPV 侵染后，海藻糖酶活性及其编码基因表达变化规律，以期为阐明BmNPV 对宿主家蚕的侵染机制和培育强健性多丝量家蚕新品种提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试家蚕品种为菁松，饲育条件为26 ℃、相对湿度(75±5)%，新鲜桑叶饲养。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 培养箱和HSW24 型电热恒温水浴锅购自广州深华生物技术有限公司；实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司；ThermoFisher 高速冷冻离心机、Bio Tek Synergy 多功能酶标仪和ThermoFisher 双光束紫外/可见分光光度计购自昆明伯腾仪器有限公司。

1.2.2 主要试剂 动物组织总RNA 抽提试剂盒购自Omega 公司；反转录试剂盒购自TaKaRa 公司；实时荧光定量PCR试剂（FastStart SYBR Green Master）购自上海翊圣生物科技有限公司；海藻糖、PBS缓冲液（pH 值为5.8）和3，5-二硝基水杨酸购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 添食病毒及样品采集 参照唐芬芬等[18]报道的方法，选取生长发育良好、大小一致的家蚕幼虫，从五龄起喂食BmNPV，每头家蚕经口喂食10 μL 的病毒悬液（含量为4.85×108个/mL），同时以喂食等体积的灭菌水为对照组（CK），随后在相同条件下用新鲜桑叶饲育。喂食BmNPV后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h和48 h，冰上解剖家蚕幼虫，取血淋巴、中肠和脂肪体，对照组同时取材。每次取样均设3 次重复，每个重复取5 头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 酶液的制备 分别取1.0 g 的中肠和脂肪体组织，置于玻璃匀浆器中，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液（pH 值为5.8），在冰上充分研磨。然后将匀浆液转移至5 mL 离心管中，在4 ℃条件下，12 000 r/min 离心10 min，取上清液作为待测酶液。取800 μL 血淋巴，加入1.2 mL 预冷的PBS 缓冲液（pH 值为5.8），12 000 r/min 离心15 min，弃沉淀取上清液，即为待测酶液。

1.3.3 海藻糖酶活性测定 在5 mL 离心管中，加0.2 mL 的 待 测 酶 液、2 mL 的PBS 缓 冲 液（pH 值5.8）和3%的海藻糖溶液0.5 mL，混匀，室温静置10 min，在37 ℃水浴锅中反应50 min，然后加入1 mL 的3，5-二硝基水杨酸终止反应，最后在沸水中煮沸5 min。冷却至室温，取适量反应液，用紫外分光光度计测定其在550 nm 处的吸光值。以等量的PBS 缓冲液（pH 值5.8）为对照。

1.3.4 总RNA 的提取和cDNA 的制备 按照Omega 公司动物组织总RNA 提取试剂盒操作说明，抽提家蚕血淋巴、中肠和脂肪体总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA 的浓度，根据TaKaRa公司反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA。

1.3.5 实时荧光定量PCR 以家蚕核糖体蛋白基因（BmRpL3）为内参基因，海藻糖酶（BmTre）基因为靶标基因，利用Primer Premier 5.0 设计实时荧光定量PCR 引物（序列见表1）。实时荧光定量PCR 参 照FastStart SYBR Green Master 试 剂 盒 操 作说明进行。 反应体系20 μL，设定程序：95 ℃30 s →（95 ℃5 s→60 ℃30 s）40 个 循环→65 ℃5 s（然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃5 s）。Bio-Rad 公司CFX-96 实时荧光定量PCR 检测仪记录数据，根据公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量[19]。

表1 实时荧光定量PCR引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

1.4 数据处理

利用Excel 2016 和SPSS 21.0 对数据进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 BmNPV对家蚕不同组织BmTre表达水平的影响

经口喂食BmNPV 后，家蚕血淋巴、脂肪体和中肠海藻糖酶基因BmTre的相对表达量变化情况如图1 所示。将对照组各个时间点BmTre的相对表达量设定为1，喂食BmNPV 组BmTre的相对表达量若大于1，表明基因上调表达，反之则下调表达。

由图1 可知，喂食BmNPV 后3 h，血淋巴BmTre的相对表达量无显著变化；在6 h、9 h和12 h，BmTre持续上调表达，相对表达量分别是对照组的2.5 倍、2.9 倍和2.6 倍；而在24 h 和48 h，BmTre的表达受到抑制，呈下调表达趋势。脂肪体BmTre 基因在9 h开始上调表达，12 h时表达量最高，24 h表达量有减弱的趋势，但仍高于对照组；在48 h，BmTre的相对表达量降至最低值，仅为对照组的35%。中肠BmTre 在喂食BmNPV 后3 h 就开始上调表达，相对表达量逐渐增加，在9 h 时表达量最高，随后在12 h时BmTre表达量开始急剧减弱，在48 h 表达量降至最低，约为对照组的13%。

2.2 BmNPV对家蚕血淋巴海藻糖酶活性的影响

如图2 所示，血淋巴海藻糖酶活性在喂食BmNPV 后6 h 开始显著增加（P＜0.05），9 h 和12 h酶活性持续高于对照组，分别是对照组的2.2 倍和1.9 倍，并且差异达到极显著水平（P＜0.01）；24 h 酶活性开始急剧降低，48 h 酶活性降至最低，仅为对照组的23%，差异达到极显著水平（P＜0.01）。

2.3 BmNPV对家蚕脂肪体海藻糖酶活性的影响

由图3 结果可知，喂食BmNPV 后3 h 和6 h，家蚕脂肪体海藻糖酶活性与对照组相比无显著差异。在9 h 酶活性开始增加，且显著高于对照组（P＜0.05）；12 h 和24 h 酶活性均高于对照组，差异达到极显著水平（P＜0.01）；而在感染48 h酶活性极显著低于对照组（P＜0.01）。整体呈现先逐渐升高后急剧降低的趋势。

2.4 BmNPV对家蚕中肠海藻糖酶活性的影响

图4 结果显示，在喂食BmNPV 后3 h，家蚕中肠海藻糖酶活性开始增加；在9 h 酶活性极显著高于对照组（P＜0.01），为对照组的2.4倍；在12 h酶活性略低于对照组，但差异不显著；在24 h 和48 h 海藻糖酶活性受到抑制，其酶活性大小分别降低至对照组的45.4%和13.5%，与对照组相比差异达到极显著水平（P＜0.01）。

3 结论与讨论

家蚕在遭受外源激素、杀虫剂和病原微生物胁迫时，机体正常的生理活动发生紊乱，参与机体免疫防御反应和物质能量代谢的一系列相关酶的活性均会发生一定程度的变化。前人[20⁃21]研究发现，用蜕皮激素20E和保幼激素JH 处理家蚕，不仅能提高蚕体血淋巴酚氧化酶原（Prophenoloxidase，PPO）基因的表达，显著增加酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）活性，而且能激活中肠碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性，增强其抗逆性。家蚕在遭受BmNPV 侵染时，机体的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和 过 氧 化 氢 酶（Catalase，CAT）活性及其基因表达量在感染中期显著升高，表明SOD 和CAT 等抗氧化酶在家蚕的抗病毒过程中发挥一定的生物学功能[18]。

海藻糖酶作为昆虫机体唯一能够水解海藻糖的酶类，不仅参与调控机体的能量代谢过程，在对抗不良环境及应对外源化合物和病原微生物胁迫时也发挥了一定的作用。家蚕海藻糖酶主要分布于血淋巴、肠液和脂肪体等组织，其在幼虫每个龄期入眠时活性相对较高[22]。用致病性较高的球孢白僵菌感染家蚕幼虫，蚕体海藻糖和糖原含量显著降低，海藻糖酶活性受到抑制，其编码基因显著下调表达[23]。本研究结果显示，在感染BmNPV 的前中期，家蚕血淋巴、脂肪体和中肠的海藻糖酶活性及BmTre基因的表达量均呈现增高的趋势；而在感染BmNPV 后期，BmTrea基因的表达显著抑制，编码的海藻糖酶活性也开始急剧减弱。感染BmNPV 后，家蚕不同组织海藻糖酶活性及其基因的表达量整体呈现先逐渐升高后急剧减弱的变化趋势。这与BmNPV 侵染蚕体的生理进程一致，在BmNPV 感染早期，病毒粒子虽然较少，但还是会对蚕体产生一定的攻击，机体通过分泌或激活相关防御因子及各类水解酶和解毒酶，增强自身的防御能力。随着BmNPV 感染时间的延长，病毒粒子大量增殖，蚕体各组织受损严重，正常生理代谢系统出现紊乱，参与机体免疫防御反应和物质能量代谢的一系列酶的活性受到抑制。另外，家蚕不同组织的海藻糖酶对BmNPV 的响应时间存在一定的差异。经口喂食BmNPV，病毒最先接触和攻击肠道组织，破坏肠道的免疫防御系统和打破正常消化代谢体系的平衡，随后进入血淋巴，最后侵染脂肪体。因此，中肠BmTre基因的表达量和海藻糖酶活性在喂食BmNPV 后3 h 就开始明显增加，在9 h 达到最高值，随后开始急剧降低。而血淋巴和脂肪体的BmTre基因分别在喂食BmNPV 后6 h 和9 h 才开始明显上调表达，其海藻糖酶的活性也增强。

综上，经口喂食BmNPV，家蚕不同组织BmTre基因的表达量及海藻糖酶活性在感染前中期增加，感染后期急剧降低，这表明海藻糖酶不仅作为一类水解酶，通过水解机体的海藻糖为蚕体提供能量物质，还可能作为一类免疫效应因子参与了家蚕抵御病毒的侵染过程。