木霉菌与杀菌剂联合使用对水稻纹枯病菌的抑制效果

张亚玲，唐雪婷，王 兵，候钰煊，赵羽涵，靳学慧

（黑龙江八一农垦大学/黑龙江省植物抗性研究中心/黑龙江省作物-有害生物互作生物学及生态防控重点实验室，黑龙江 大庆 163319）

水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的土传病害，严重影响水稻生产安全[1]。生产上对水稻纹枯病的防治仍以化学防治为主，赵敏等[2]研究表明，30%肟菌·戊唑醇、5%已唑醇对水稻纹枯病的防效分别达到76.3%、83.8%。唐正合等[3]通过离体抑菌试验研究了丙环唑对水稻纹枯病菌的抑制作用，结果表明，丙环唑能够强烈抑制水稻纹枯病菌菌丝生长。近年来，利用有益微生物对水稻纹枯病进行生物防治取得了明显的效果，木霉属(Trihcoderma)真菌是对水稻纹枯病防治应用研究较多的一种真菌。周晓梅等[4]研究表明，哈茨木霉、绿色木霉、长枝木霉对多种病原细菌有拮抗作用，其中，哈茨木霉对水稻纹枯病菌具有很强的重寄生能力。但这些有益微生物在田间使用过程中存在防效低、药效易受环境条件影响等缺点，尚无法完全替代化学杀菌剂[5]。如果能将有益生物农药与化学农药联合使用，或进行减量复配，实现增效的目的，则是解决该问题的重要途径[6]。胡婕等[7]、GUPTA 等[8]、张蜻迪等[9]研究表明，化学杀菌剂与木霉菌联合后对植物病害的防治具有协同作用，即两者联合使用比单独一种药物作用效果更好。目前，关于木霉菌与防治水稻纹枯病的常用化学药剂联合使用的协同作用研究尚未系统报道，鉴于此，初步探索了3种木霉菌和防治水稻纹枯病常用杀菌剂及其联合使用对水稻纹枯病菌的抑制作用，以期为生产上合理使用生防菌剂和化学药剂防治水稻纹枯病提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

供试生防菌株：哈茨木霉菌HZT-1、长枝木霉CZT-2和绿色木霉菌LZT-3由黑龙江八一农垦大学植物抗性研究中心实验室分离、鉴定并保存；供试水稻纹枯病菌由黑龙江八一农垦大学植物抗性研究中心研究人员田间采集病株，经实验室分离、鉴定并保存。

1.2 供试药剂

供试化学杀菌剂为生产上防治水稻纹枯病的常用化学药剂：20%丙环唑乳油（北京中农药工有限公司）、25%嘧菌酯悬浮剂（浙江博仕达作物科技有限公司）、20%噻唑锌悬浮剂（浙江新农化工股份有限公司）、125 g/L 氟环唑悬浮剂（江苏七洲绿色化工股份有限公司）。

1.3 供试培养基

PDA 培养基：马铃薯200 g，加水1 000 mL，煮沸30 min，冷后用双层纱布过滤，滤液内加15 g 琼脂、20 g 葡萄糖，加水补足至1 000 mL，高压灭菌30 min后备用。

1.4 试验方法

1.4.1 杀菌剂对水稻纹枯病菌的室内毒力测定

用无菌水在无菌条件下配制不同质量浓度的化学杀菌剂溶液，采用菌丝生长速率法[10]测定参试4种化学杀菌剂对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用。具体方法如下：准确量取各药剂母液，分别用灭菌水稀释成5个不同的质量浓度梯度。取稀释后的药液加入到已灭菌的PDA 培养基中（V药剂∶V培养基=1∶9），制成含药PDA 平板，以PDA 培养基中加入等量灭菌水为空白对照。用打孔器打取培养在PDA培养基中的水稻纹枯病菌菌饼（直径5 mm），将菌丝面向下接种于含药PDA 培养基平板中央，每个药剂质量浓度处理重复4次，试验重复3次，在25 ℃恒温培养箱中培养3 d 后用十字交叉法测量菌落直径，按照公式（1）计算抑菌率（I）。

式中，Dc 为对照组菌落直径（cm），Dt 为处理组菌落直径（cm）。

1.4.2 木霉菌对水稻纹枯病菌的抑菌研究 采用对峙培养法研究木霉菌对水稻纹枯病菌的抑制作用[11]。将直径为5 mm 的3 种木霉菌菌饼和水稻纹枯病菌菌饼分别组合接种到距离平板中央相等的2 个点上，以不接种木霉菌菌饼为对照，每个处理重复3 次，25 ℃恒温培养3 d 后，测定菌落直径，按照公式（2）计算抑菌率（I）。

式中，RCK为对照病原菌菌落直径(mm)，RB为与木霉菌对峙培养的纹枯病菌菌落直径(mm)。

1.4.3 杀菌剂与木霉菌联合使用对水稻纹枯病菌的抑制作用测定

1.4.3.1 杀菌剂对木霉菌的抑菌作用 在化学药剂与生防菌联合使用之前首先要明确二者相容性。将4 种化学杀菌剂按照需要分别配制成母液，量取各化学杀菌剂母液，用无菌水分别稀释成5 个不同质量浓度梯度，25%嘧菌酯1.25～20.0 μg/mL，20%丙环唑0.32～20 μg/mL，125 g/L 氟环唑0.003 2～20 μg/mL，20%噻唑锌0.37～30.0 μg/mL。取1 mL 稀释后的药液加入到已灭菌的9 mL PDA 中，制成含药PDA 平板，分别接种经活化培养（25 ℃，2 d）的3 种木霉菌（菌饼直径=5 mm，菌饼间相距3 cm），以不含药PDA 平板上接种3 种木霉菌菌饼为空白对照。每个质量浓度处理重复4 次，试验重复3 次。将PDA 平板倒置于25 ℃恒温培养箱中培养48 h 后，测量菌落直径，参考公式（1）计算抑制率。

1.4.3.2 杀菌剂与木霉菌联合使用相容性评价标准 参照马志强等[11]的试验方法，根据化学杀菌剂对木霉菌的EC50（TEC50）与该杀菌剂对致病菌的EC50（REC50）比值（VEC50，公式3）筛选可与木霉菌联合使用的杀菌剂，若VEC50＞1，认为该化学杀菌剂可与生防木霉菌联合使用。

1.4.3.3 木霉菌和杀菌剂联合使用对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制作用 根据1.4.3.2 杀菌剂与生防木霉菌的相容性测定结果，选择相容性好的25%嘧菌酯、20%噻唑锌与3 种木霉菌联合使用评价效果。研究方法参考牛芳胜[12]的试验方法。分别量取25%嘧菌酯和20%噻唑锌，用灭菌水稀释成5 个不同质量浓度梯度制成含药PDA 平板，25%嘧菌酯质量浓度梯度为1.25、2.5、5、10、20 μg/mL，20%噻唑锌质量浓度梯度为10、20、30、40、50 μg/mL。同时接种经活化培养（25 ℃，2 d）的木霉菌和水稻纹枯病菌菌饼（菌饼直径5 mm，菌饼间相距3 cm）。以含药PDA 平板上单独接入木霉菌或水稻纹枯病菌菌饼和不含药PDA 平板上同时接种木霉菌和纹枯病菌为对照。每个处理重复3 次，试验重复3 次。将PDA 平板倒置于25 ℃恒温培养箱中培养3 d，测量两菌菌落的相向半径。

1.4.3.4 木霉菌与化学杀菌剂联合使用增效作用的评价方法 木霉菌与化学杀菌剂联合使用是否产生增效作用的评价方法参考牛芳胜[12]的协同系数法，协同系数（S）的计算见公式（4）。

式中，RTCK和RRCK分别表示木霉菌和水稻纹枯病菌的对照菌落半径；RTt和RRt分别表示木霉菌和水稻纹枯病菌的对峙菌落相向半径。S≥1.5，表示木霉菌和化学药剂具有增效作用；1≤S＜1.5，表示木霉菌和化学药剂具有相加作用；S＜1，表示木霉菌和化学药剂具有拮抗作用。

本试验以S值作为筛选可与木霉菌联合使用的杀菌剂标准，若S≥1，则认为该化学药剂可与生防木霉菌联合使用。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用

由表1 可见，4 种杀菌剂对水稻纹枯病菌都有较强的抑制活性，4 种杀菌剂中，EC50值从小到大依次为25% 嘧菌酯（0.001 4 μg/mL）、20% 丙环唑（0.003 7 μg/mL）、125 g/L 氟环唑（0.222 0 μg/mL）、20%噻唑锌（20.750 0 μg/mL）。25%嘧菌酯、20%丙环唑和125 g/L 氟环唑均表现出良好的抑菌效果，20%噻唑锌的抑制效果相对较低。

表1 4种化学杀菌剂对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of four fungicides to Rhizoctonia solani by mycelium growth rate method

2.2 木霉菌对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用

由图1 可见，3 种木霉菌对水稻纹枯病菌均具有较好的抑制作用，其中，长枝木霉CZT-2 的抑制作用最好，抑制率达93.25%；其次为绿色木霉LZT-3，抑制率为76.45%；哈茨木霉菌HZT-1对水稻纹枯病菌的抑制率相对较低，为53.54%。

2.3 杀菌剂与木霉菌联合使用对病原菌的抑制作用

2.3.1 杀菌剂与木霉菌的相容性 杀菌剂与木霉菌联合使用时，需尽量避免杀菌剂影响木霉菌的活性。联合应用时原则上应选择对木霉菌无抑制作用的杀菌剂，但在实际中这类化学杀菌剂和生防菌为数不多。本研究利用VEC50＞1 作为筛选可与木霉菌联合使用的杀菌剂标准，结果见表2。由表2可见，4 种化学杀菌剂对3 种木霉菌和水稻纹枯病菌菌丝生长均有抑制作用，25%嘧菌酯和20%噻唑锌对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用始终大于对木霉菌的抑制作用，其VEC50＞1；20%丙环唑和125 g/L氟环唑对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用始终小于对木霉菌的抑制作用，其VEC50＜1。说明25%嘧菌酯和20%噻唑锌可与3种木霉菌联合使用。

从表2 还可以看出，绿色木霉菌LZT-3 对25%嘧菌酯最敏感，EC50值为0.522 3 μg/mL，长枝木霉菌（CZT-2）和哈茨木霉菌（HZT-1）对25%嘧菌酯的敏感 性 相 对 较 差，EC50值 分 别 为40.738 0 μg/mL 和34.673 6 μg/mL。长枝木霉菌（CZT-2）对20%噻唑锌相对较敏感，其EC50值是32.700 3 μg/mL，绿色木霉菌（LZT-3）和哈茨木霉菌（HZT-1）的EC50值分别为128.820 4 μg/mL 和549.541 1 μg/mL。20%丙环唑和125 g/L氟环唑对木霉菌均有较强的抑制作用。

表2 4种杀菌剂对水稻纹枯病菌和木霉菌的抑制作用Tab.2 Inhibition effect of four fungicides against R.solani and Trichoderma by mycelial growth rate method

续表2 4种杀菌剂对水稻纹枯病菌和木霉菌的抑制作用Tab.2（Continued） Inhibition effeit of four fungicides against R. solani and Trichoderma by mycelial growth rate method

2.3.2 木霉菌与杀菌剂联合使用对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制的增效作用 通过杀菌剂与生防木霉菌的相容性测定，选择相容性好的25%嘧菌酯、20%噻唑锌与3 种木霉菌联合使用，应用协同系数法评价联合使用后的增效作用，结果见表3，其培养生长状况见图2 和图3。表3 表明，绿色木霉LZT-3、长枝木霉CZT-2 与25%嘧菌酯、20%噻唑锌联合使用的协同系数（S）均大于1，说明二者联合使用后有增效作用，且随着25%嘧菌酯质量浓度增加，协同系数（S）值增大，在低质量浓度（1.25 μg/mL）25%嘧菌酯下表现相加作用，在高质量浓度（≥2.5 μg/mL）25%嘧菌酯下表现为增效作用。哈茨木霉菌与低质量浓度25%嘧菌酯（1.25 μg/mL）、20%噻唑锌（10 μg/mL）联合使用表现出拮抗作用，与高质量浓度25%嘧菌酯（≥2.5 μg/mL）、20%噻唑锌（≥20 μg/mL）联合使用表现相加作用和增效作用。

表3 木霉菌与杀菌剂联用对水稻纹枯病菌菌丝的抑制及增效作用评价Tab.3 Inhibition and synergism of Trichoderma and fungicides on mycelium of R.solani

3 结论与讨论

本研究采用3 种木霉菌分别与4 种常用化学杀菌剂相组合，研究其对水稻纹枯病菌（立枯丝核菌）的抑制效果，通过EC50值比值(VEC50)判断化学杀菌剂与3种生防木霉菌的相容性，利用协同系数（S）比较其联合使用后是否有增效作用。结果表明，参试4种化学杀菌剂和3 种木霉菌对水稻立枯丝核菌均有抑制作用；通过VEC50值分析，25%嘧菌酯和20%噻唑锌与3 种木霉菌的相容性好，可与木霉菌联合使用。通过协同系数（S）分析联合使用后的增效作用，发现绿色木霉、长枝木霉分别与25%嘧菌酯、20%噻唑锌联合使用有相加作用和增效作用，哈茨木霉菌与高质量浓度25%嘧菌酯、20%噻唑锌联合有增效作用。长枝木霉、绿色木霉可与25%嘧菌酯、20%噻唑锌联合使用，作为防治水稻纹枯病的优良微生物资源，具有良好的开发前景。

木霉菌主要是以强大的竞争能力和重寄生特性实现其生物防治作用[13⁃14]，其对多种植物病原菌表现出拮抗作用[15⁃19]。如景芳等[20]、牛鑫斌等[21]利用长枝木霉T6 制成水分散粒剂，其产孢量大、孢子萌发率高，田间竞争力较强，对Fusariumspp.、Pythiumspp.、Phytophthoraspp.、R.solani等多种土传病害病原菌均有较好的抑制作用。本试验中，参试3种木霉菌株对水稻纹枯病菌均有抑制作用，其中长枝木霉CZT-2 的抑制效果最好，抑制率达93.25%。因此，长枝木霉CZT-2 菌株可作为防治水稻纹枯病的生防菌种资源。

化学药剂是田间防治水稻纹枯病的常用药剂。本研究采用的丙环唑和氟环唑为三唑类广谱杀菌剂，其作用机制是影响甾醇的生物合成，从而导致细胞死亡[22]；嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，作用机制主要是抑制线粒体呼吸产生ATP 来抑制病原菌的能量合成[23]。本研究发现，25%嘧菌酯、20%丙环唑和125 g/L 氟环唑对水稻纹枯病菌抑制效果较好，这与刘显良等[24]的研究结果一致。噻唑锌结构由2个功能基团组成，一是噻唑基团，病原菌没有侵染进入前，该基团对致病菌无抑制作用，但病原菌侵入植物体后有较好的抑菌作用；二是锌离子，既具有保护作用又有治疗作用[25]。本研究发现，20%噻唑锌的抑制效果较其他3 种药剂差些，这可能是因为在植物体外的抑菌试验中只有1个功能基团（锌离子）起作用，可进一步进行田间防治试验明确其防效。

在研究化学药剂与生防菌剂联合使用时首先要明确2 种物质的相容性。本研究测定了3 种木霉菌和水稻立枯丝核菌对4 种化学杀菌剂的敏感性，利用EC50值比值（VEC50）确定化学杀菌剂与生防菌剂的相容性。研究发现，4 种化学杀菌剂中25%嘧菌酯和20%噻唑锌对水稻纹枯病菌的抑制作用强于对木霉菌的抑制作用，VEC50＞1，表明这2 种杀菌剂虽对木霉菌和水稻纹枯病菌均有抑制作用，但对木霉菌的抑制作用小于对水稻纹枯病菌的抑制作用，木霉菌可发挥其生防作用。牛芳胜[12]研究嘧菌酯对木霉菌和灰霉病菌的抑制作用，发现其VEC50＞1，与本研究结果相似。20%丙环唑和125 g/L 氟环唑对木霉菌的抑制作用大于对水稻纹枯病菌的抑制作用，VEC50＜1，说明二者对木霉菌的毒力大于对水稻纹枯病菌的毒力，杀菌剂在抑制水稻纹枯病菌的同时也抑制了木霉菌的生长，因此不能充分利用木霉菌的生防活性。如果杀菌剂对木霉菌无抑制作用时，VEC50值趋于无限大，联合后木霉菌将不受药剂的影响，能充分发挥两者的联合作用。

从4 种化学杀菌剂与生防菌的相容性结果发现，3 种木霉菌对25%嘧菌酯和20%噻唑锌的耐受能力更强，可联合使用。本研究采用协同系数法评价杀菌剂与木霉菌联合使用的协同增效作用，结果发现，在杀菌剂一定质量浓度下存在协同增效作用。谢立等[26]研究了杀菌剂与生防菌联合使用后对植物病害防治具有协同作用，两者联合使用可以提高防治效果。李敏等[27]研究了哈茨木霉与多菌灵复合使用对水稻苗期立枯病的防治效果，结果表明，联合使用比单独使用多菌灵和哈茨木霉防治效果分别提高26.87%和9.90%。本试验结果表明，相比于单独使用杀菌剂和木霉菌，绿色木霉LZT-2、长枝木霉CZT-2 与杀菌剂嘧菌酯、噻唑锌联合使用抑菌效果更好，具有增效作用和相加作用，下一步将进行田间试验，评价二者联合使用后的田间效果。