Cd2+、Pb2+胁迫下对开蕨配子体发育的比较研究

王梓丞，杨 硕，关 旸，2，刘保东，2

（1. 哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨 150025；2. 黑龙江普通高等学校植物生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150025）

对开蕨(Phyllitis japonicaKom.)属铁角蕨科(Aspleniaceae)，主要分布于我国吉林省长白山南麓和西部地区，具有较高的观赏价值[1⁃2]，是东北地区稀有的四季常绿蕨类植物，有成为城市特色绿化植物的前景[3⁃4]，但由于生境被破坏，野生资源逐渐濒危，我国于1999年正式批准对开蕨为国家二级重点保护野生植物。最新研究表明，对开蕨种群较小且不稳定，自然繁殖能力较弱，幼苗处于衰退阶段[5⁃6]。有学者研究表明，蕨类种群幼苗减少与环境污染有关[7⁃8]，环境污染会破坏植物的生殖能力，还会扰乱植物的生理生化过程，对植物造成伤害[9⁃11]。因此，环境污染可能是对开蕨种群幼苗减少的原因之一。

重金属污染已经成为我国城市的主要环境问题之一，其中Cd 和Pb 是城市主要的污染物。Cd 和Pb 是植物非必需元素，若在土壤中含量过高，会对植物产生不利影响[12⁃14]。配子体是蕨类植物有性生殖的关键环节，较孢子体与成株更易受到环境污染的影响。尽管对对开蕨配子体的研究已取得了许多成果，但多是在不同培养条件下对孢子繁殖、配子体发育[15⁃16]的观察研究，或对孢子体生活史[17]及环境适应性方面的研究[18⁃20]，且都是在非胁迫条件下完成的，而胁迫条件下对开蕨配子体发育的相关研究少见报道。虽然肖湘等[8]、汪盛等[21]对重金属胁迫下桫椤配子体发育进行了研究，但蕨类植物的形态结构、生活习性皆不相同，这意味着其系统发育和生殖结构有着很大差异。因此，阐明对开蕨配子体在逆境胁迫下的发育情况，既是对蕨类生殖生物学的补充，也可为对开蕨成为城市特色绿化植物提供基础资料。

鉴于此，以对开蕨配子体为材料，分别以2种常见重金属污染物Cd2+、Pb2+进行单一胁迫，观察对开蕨配子体发育的变化，旨在探讨对开蕨幼苗减少与重金属污染之间的联系，进一步探索对开蕨配子体对Pb、Cd的耐受性，为对开蕨保护提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

对开蕨孢子于2016 年采自长白山，置于4 ℃冰箱内保存，凭证标本现存于哈尔滨师范大学标本馆。

1.2 试验设计

试验于2020 年9 月在哈尔滨师范大学生物实验室进行，土壤处理参考纪善博[7]的方法。取42 个透明、容积为1 L 的方形塑料容器，向其中分别加入300 g土（以干土计），均分为7个处理，每个处理6次重复。根据含水量的设计，向对照（CK）加入一定体积的水，使土壤含水量达到35%；3 个Cd2+处理分别加入一定体积、不同浓度的CdCl2溶液，使土壤中Cd2+含量分别达到0.2、0.4、0.8 mg/kg，土壤含水量为35%；3 个Pb2+处理分别加入一定体积Pb（NO3）2溶液，使土壤中Pb2+含量分别达到20、40、80 mg/kg，土壤含水量为35%。在以上7个处理土壤中播种对开蕨孢子，孢子播种方法同檀龙颜等[22]。

播种后置于培养室内，光照时间12 h/d。播种后按时浇水，使土壤含水量保持在33%～36%。播种25 d 后，每3 d 观察各组配子体长势情况，40 d 后用Olympus 的SZX2-FOF 和BX53 显微镜进行随机镜检，配子体成熟后拍照。

1.3 数据分析

时间数值以孢子播种后第一次观察到出现性状为准。统计方法采用样方法，在塑料容器中均匀取9 个3 cm × 3 cm 的样方，在显微镜下统计，重复10次。数据采用Excel和R语言进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Cd2+、Pb2+胁迫对对开蕨配子体发育的影响

由表1 可知，Cd2+、Pb2+对对开蕨心形原叶体、颈卵器的形成时间以及精子器、颈卵器、假根、毛状体的数目影响显著，但对精子器形成时间影响不显著。0.2 mg/kg Cd2+处理下，精子器数目增加，但与CK 差异不显著；而颈卵器、假根、毛状体的数目均呈下降趋势，颈卵器、假根的数目与CK 差异显著，毛状体数目与CK 差异不显著。随着Cd2+含量进一步升高，精子器、颈卵器、假根、毛状体的数目显著下降，0.8 mg/kg Cd2+处理分别较CK 下降61.5%、65.1%、73.7%、58.0%。随着Pb2+含量升高，精子器、颈卵器、假根、毛状体的数目显著下降，80 mg/kg Pb2+处理分别较CK 显著下降56.5%、65.8%、35.9%、52.8%。

表1 Cd2+、Pb2+胁迫对对开蕨配子体发育的影响Tab.1 Effects of Pb2+and Cd2+on the development of Phyllitis japonica gametophyte

2.2 Cd2+、Pb2+胁迫对对开蕨配子体叶绿体结构的影响

正常对开蕨配子体叶绿体呈绿色，排列均匀（图1a）；0.2 mg/kg Cd2+胁迫下，叶绿体结构变化较小（图1b）；0.4 mg/kg Cd2+处理下，叶绿体边缘出现黄化现象（图1c）；0.8 mg/kg Cd2+处理下出现叶绿体融合现象（图1d）。

20 mg/kg Pb2+处理下叶绿体结构变化较小（图1e），40 mg/kg Pb2+胁迫下，叶绿体出现黄化（图1f），或伴有细胞溶解（图1g）；80 mg/kg Pb2+处理下，细胞黄化、溶解现象增加（图1h）。

2.3 Cd2+、Pb2+胁迫对对开蕨配子体精子器的影响

对开蕨精子器为无色透明状的圆球形，发育初期可见精子器内产生精母细胞（图2a）；在0.2 mg/kg Cd2+胁迫下，部分精子器外观无明显变化，精子仍可以自由释放，但部分精子器释放缓慢（图2b）；0.4 mg/kg Cd2+处理下，精子器细胞壁出现破损现象，释放的精细胞也呈现黄色（图2c）；0.8 mg/kg Cd2+处理下多数精子器精子无法自由释放，并伴有黄斑出现（图2d），导致其失去精子器的功能。

20 mg/kg Pb2+处理下，对开蕨配子体的精子器出现破损情况（图2e）；40 mg/kg Pb2+处理下精子器细胞壁出现黄化现象（图2f）；80 mg/kg Pb2+处理下，精子器黄化现象更明显（图2g、h），但无Cd2+胁迫下精子器黄斑现象的发生。

2.4 Cd2+、Pb2+胁迫对对开蕨配子体颈卵器的影响

对开蕨颈卵器正常情况下呈淡绿色，含有少量叶绿体，成熟颈部是由4 列细胞组成（图3a）；0.2 mg/kg Cd2+处理下，部分颈卵器顶端到底部颜色逐渐发黄（图3b）；0.4 mg/kg Cd2+处理下，颈卵器颈沟发黄坏死，底部出现黑色异物（图3c）；0.8 mg/kg Cd2+处理下，颈卵器坏死现象明显，可能导致颈卵器无法正常打开，使其受精失败（图3d）。

20 mg/kg Pb2+处理下，颈卵器底部出现黄化现象（图3e）；40 mg/kg Pb2+处理下，部分颈卵器底部出现黑色异物（图3f），颈卵器从底部向顶端逐渐变黄（图3g）；80 mg/kg Pb2+处理下颈卵器出现破损、坏死现象（图3h）。

2.5 Cd2+、Pb2+胁迫对对开蕨配子体假根的影响

对开蕨假根正常呈现笔直或略有弯曲的管状（图4a）；0.2 mg/kg Cd2+处理对假根影响不明显（图4b）；0.4 mg/kg Cd2+处理下，出现假根弯曲现象（图4c）；0.8 mg/kg Cd2+处理下假根出现褐变、弯曲的现象（图4d）。

20 mg/kg Pb2+处理下，假根出现短小现象（图4e）；40 mg/kg Pb2+处理下，出现区域性褐变（图4f）；80 mg/kg Pb2+处理下，假根出现弯曲、渗漏与褐变现象（图4 g、h）。

3 结论与讨论

叶绿体是植物生长发育的重要组成部分，重金属通过破坏植物叶绿体结构以及抑制相关酶的活性影响植物的光合作用[23⁃24]。本研究结果表明，对开蕨配子体在Cd2+、Pb2+胁迫下，叶绿体有黄化现象发生，随重金属胁迫程度升高，配子体叶绿体边缘黄化、融合现象增加，并伴有坏死等现象。这可能是由于植物叶绿体受到重金属胁迫时，内部产生大量活性氧及过氧化物，使叶绿体内部系统紊乱，进而对结构造成破坏[25]。

精卵结合是蕨类植物有性生殖的关键环节，最新研究结果表明，重金属会使桫椤类植物的精子器及精卵器形态发生畸变，并且畸变比率与胁迫浓度呈正相关[8]。本研究发现，在Cd2+胁迫下，多数精子器精子无法自由释放，偶有黄斑出现，纪善博[7]在研究中也发现，在Cd2+胁迫下，中华桫椤配子体的颈卵器有黄斑现象，而在Pb2+胁迫下，精子器无黄斑现象。在Cd2+、Pb2+胁迫下，颈卵器底部均出现黑色异物，在Cd2+胁迫下，颈卵器从顶端到底部逐渐变黄，而在Pb2+胁迫下，部分颈卵器从底部向顶端逐渐变黄，说明不同重金属对同种植物生殖系统的破坏机制也不尽相同。精子器发生变化后，可能改变精子位移和自转频率等，导致精子不能够进入颈卵器完成受精[11]。而颈卵器颈沟发黄坏死，导致颈卵器无法正常打开，不能正常接收精子，最终导致精卵结合失败。

假根是蕨类配子体吸收营养物质的主要器官[8]，对配子体的生长发育有着重要作用。研究表明，重金属会对植物根系的形态产生影响[26⁃27]，同时也对植物的生长发育产生影响[28]。本研究表明，Cd2+、Pb2+胁迫下，对开蕨配子体假根产生了不同程度的畸变，这可能是由于根部为了适应环境所产生的变化[29]。对对开蕨配子体假根、毛状体、精子器与颈卵器数量进行统计发现，在高含量Cd2+、Pb2+胁迫下，精子器数、颈卵器数、假根数、毛状体数量明显下降，与对照差异显著。因此推测，可能是由于假根发生畸变，导致配子体吸收、运输等能力变弱，最终配子体发育受阻。

本研究表明，对开蕨配子体在受到重金属胁迫时，其形态结构的变化与重金属含量有着密切联系，说明对开蕨配子体对污染较为敏感。相比于成株，对开蕨配子体抗性较弱，不适宜种植在重金属含量较高的土壤中。若对开蕨配子体的叶绿体出现发黄、精子器出现黄斑等特殊现象，说明土壤可能受到重金属污染。本研究设置的Cd2+、Pb2+含量较低，对其他种子植物尚不能造成明显伤害，而对于自然繁殖能力脆弱的对开蕨而言，已经对配子体发育造成严重的伤害，并可能影响其正常的精卵结合，严重时可能会导致植物死亡[30⁃31]。