61 份高油大豆品种（系）指纹图谱构建及遗传多样性分析

李 琼，李金花，常世豪，杨青春，舒文涛，耿 臻

（周口市农业科学院，河南 周口 466001）

大豆是我国重要的油料作物，在植物油生产中占有重要地位[1]。我国大豆种植面积小，大豆品种出油率较进口转基因大豆低，大豆油消费的主要来源仍然依靠进口。2020 年我国进口大豆10 032.7万t，同比增长17%，创下历史新高[2⁃3]。在我国大豆产量总体不足的情况下，选育及种植高油大豆品种是提高国内产油量的有效途径之一。我国高油大豆品种主要种植在北方地区，但生产上油分含量高、丰产性好的品种十分匮乏[4]。选育高油大豆的基础是对高油大豆种质资源的搜集和合理利用。分析高油大豆种质资源的遗传多样性，可探索种质材料间的亲缘关系。通过种质材料遗传背景的分析，指导亲本间的选配，可充分发挥其杂种优势，加快实现育种目标。因此，分析高油大豆种质资源的遗传多样性，对育种亲本材料的筛选和高油大豆品种的选育具有重要意义。

SSR分子标记具有操作简便、周期较短、多态性丰富和重复性高等特点，基于SSR 分子标记的指纹图谱身份证技术已被广泛应用于大豆品种遗传特异性鉴定[5]。陈亮等[6]以98 份吉林省大豆品种为试验材料，利用12 对SSR 引物构建出由7 对SSR 标记组成的核心引物组合，实现对试验材料的逐一区分。王帅等[7]以60份东北地区大豆疫霉根腐病抗性品种为试验材料，利用35对SSR 引物对其进行遗传多样性分析，构建出由5 对SSR 引物组成的指纹图谱。中国是大豆起源的中心，地域辽阔、地形复杂多样，拥有最为丰富的大豆自然群体。然而，人工选育大豆品种（系）过程中，对优良亲本的重复利用，造成大豆遗传背景逐渐单一。目前，关于大豆遗传多样性的分析及SSR 指纹图谱的构建多是针对个别省份或地区进行，同时对多个区域高油大豆种质资源的研究较少。鉴于此，基于68 对SSR 引物，对中国和来自美国的共61份高油大豆品种（系）进行遗传多样性分析并构建指纹图谱，为高油大豆种质资源保存、新品种保护及育种亲本的选择等提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

采用近红外光谱仪测定286 份大豆品种（系）[包括国家区试参试品种（系）和美国引进大豆品种（系），由中国农业科学院和周口市农业科学院提供]的脂肪含量，根据国家大豆品质区试中高油大豆的判定标准（脂肪含量≥21.5%），从中筛选出脂肪含量≥21.5% 的61 份高油大豆材料作为供试材料（表1）。根据品种（系）产地来源及种植生态区，将来自辽宁、黑龙江、山西、河北、北京的高油大豆材料归为群体A（编号P1—P32，主要来源于北方春大豆区以及黄淮海夏大豆中部和北部片区），将来自河南、山东、安徽、江苏、湖北的高油大豆材料归为群体B（编号P33—P50，主要来源于黄淮海夏大豆南部片区和长江流域夏大豆区），将美国引进高油大豆材料归为群体C（编号P51—P61）。

表1 61份大豆高油品种（系）名称及产地来源Tab.1 Names and origins of 61 high-oil soybean varieties（lines）

1.2 方法

1.2.1 大豆DNA 提取及引物合成 选取2 粒饱满的大豆种子在育苗盘中种植，放置在培养箱（25 ℃，光照8 h/d）内培育出3 片复叶。采集鲜嫩叶片按照CTAB 法[8]提取DNA。采用紫外分光光度计测定DNA 质量浓度，并稀释至50 ng/μL，放置于-80 ℃冰箱备用。参考http://soybase.org/公布的引物标记和参考文献[9-11]中与大豆品质（油分、蛋白质）相关的引物标记，选取分布于20条连锁群上的88对SSR引物，并从中筛选出多态性较好的68 对引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 PCR 扩增及产物检测 PCR 反应体系为10 μL，包括DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×TranTaq-PCRSuper-Mix 5 μL，加水补足。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压180 V，时长2.5 h，银染法染色，即时拍照。

1.2.3 数据分析 同一位置有条带赋值为“1”，无条带则赋值为“0”，在Excel 中建立61 份材料的“0/1”矩阵。用POPGEN 32 软件计算不同群体的等位基因数（Allele number，Na）、有效等位基因数（Effective number of allele，Ne）、Shannon’s 信息指数[12]（Shannon’s information index，I）、遗传相似度（Genetic identity，GI）、遗传距离（Genetic distance，GD）、多 态 位 点 比 率（Percentage of polymorphic bands，PPB）、Nei’s 基因多样性指数（H）、总遗传多样度（Ht）、群体内遗传多样度（Hs）、群体间遗传分化系数（Gst）和基因流（Nm*）等并进行对比分析，计算引物的多态性信息含量（Polymorphism information content，PIC）[13]。利用NTSYS 软件进行遗传相似性分析，计算遗传相似系数（Genetic similarity，GS），并采用非加权配对法UPGMA 和SHAN 程序进行聚类分析，Eigen 程序进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。将高油大豆品种（系）以十进制数据构建指纹图谱[14]。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

利用68 对引物（表2）分别对61 份高油大豆品种（系）进行PCR扩增，共检测出203个条带，多态性条带为199 个，PPB 为98.03%。PIC 变幅为0.236～0.978，平均为0.627。PIC可以衡量基因变异程度的高低。朱振东等[15]认为，PIC＞0.5 时，该引物为高度信息引物。由此可见，本研究所选取的68 对引物中，其中50对具有较高的多态性。

表2 供试材料SSR引物多态性信息Tab.2 Polymorphism information of SSR primers in the tested materials

2.2 高油大豆品种（系）DNA指纹图谱的构建

根据68对SSR 引物的扩增结果，统计基因型个数。选取基因型较多且PIC 较高的引物对61 份大豆品种（系）进行区分。参照PIC值由高到低依次加入SSR 引物，逐步对材料进行鉴定，直到把所有品种（系）区分开。由表3 可知，SSR 引物sat_304、satt708、satt373、satt216 可区分67.74%（41 份）的材料；SSR 引 物sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463 可区分88.71%（54 份）的材料；SSR 引物sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631 可区分96.77%（59 份）的材 料；sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631 和satt268 七对引物可把61份高油大豆品种（系）区分开。按照sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631、satt268 的引物组合顺序将每份材料对应的扩增结果转化为二进制“0/1”代码，得到每个品种（系）独立的唯一编码，构成61 份高油大豆材料的指纹图谱（表4）。本研究筛选得到的7 对核心引物可将61 份高油大豆品种（系）完全分开，从分子水平上将DNA指纹图谱技术应用于高油大豆品种（系）的鉴定、识别。

表3 逐个增加SSR标记引物组合对高油大豆品种（系）的区分情况Tab.3 Differentiation of high-oil soybean varieties（lines）by adding SSR marker primer combinations one by one

表4 7对引物构建的61份高油大豆品种（系）的SSR指纹图谱Tab.4 SSR fingerprints of 61 high-oil soybean varieties（lines）constructed by seven pairs of primers

续表4 7对引物构建的61份高油大豆品种（系）的SSR指纹图谱Tab.4（Continued） SSR fingerprints of 61 high-oil soybean varieties（lines）constructed by seven pairs of primers

2.3 不同高油大豆群体间遗传多样性、遗传距离和遗传变异分析

由表5 可见，供试61 份高油大豆品种（系）的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s 基因多样性指数（H）、Shannon’s 信息指数（I）分别为1.980 3、1.414 2、0.272 4、0.429 7，多态性位点数为199，多态位点比率（PPB）为98.03%。各群体间遗传多样性指标存在差距，群体A（Na=1.955 7，Ne=1.424 5，H=0.263 7，I=0.414 7，PPB=95.57%）＞群体B（Na=1.921 2，Ne=1.416 8，H=0.261 3，I=0.408 8，PPB=92.12%）＞群 体C（Na=1.743 8，Ne=1.370 0，H=0.225 7，I=0.347 6，PPB=74.38%），表明群体A 遗传多样性最丰富，群体B 次之，群体C 遗传多样性最差。3 个大豆群体的总遗传多样度（Ht）、群体内遗传多样度（Hs）、群体间遗传分化系数（Gst）和基因流（Nm*）分别为0.276 9、0.250 2、0.096 4和4.688 7。由此可见，9.64%的遗传变异存在于3 个群体之间，90.36%的遗传变异存在于群体内部。3个群体间差异较小，存在低度分化，但群体内部个体差异较大，群体间基因交流较为丰富。

表5 不同高油大豆群体的遗传多样性指标Tab.5 Genetic diversity index of different high-oil soybean groups

由表6 可知，群体A 与群体B 的遗传相似度（GI）为0.974 4，遗传距离（GD）为0.025 9；群体A与群体C 的遗传相似度（GI）为0.944 2，遗传距离（GD）为0.057 4；群体B 与群体C 的遗传相似度（GI）为0.922 5，遗传距离（GD）为0.080 7。由此可见，3 个群体间遗传相似性高，遗传距离较近，即3个群体遗传背景较为相似，亲缘关系较近。3 个群体之间遗传距离比较可知，群体B 与群体C 亲缘关系最远，群体A 与群体C 亲缘关系居中，群体A与群体B 亲缘关系最近。

表6 不同高油大豆群体间的遗传相似度（GI）和遗传距离（GD）Tab.6 Genetic identity（GI）and genetic distance（GD）between different high-oil soybean groups

2.4 不同高油大豆品种（系）的聚类分析和主成分分析

利用68 对引物（表2）分别对61 份高油大豆品种（系）进行PCR 扩增，采用NTSYS 软件对68 对SSR 引物的扩增数据进行分析，计算并建立遗传相似度矩阵，进行UPGMA 聚类。结果（图1）表明，61份材料的遗传相似系数（GS）在0.61～0.87。遗传相似系数在0.63 处，61 份材料被分为四大类群。类群Ⅰ中有2 份材料，包括开科源特早和辽04M05-4，这2 个品种均为菜豆品种（属群体A）；类群Ⅱ中有12份材料，包括AU1、AU2、AU3 等11 份材料（属群体C）和1 份材料（合交2001-336-7）（属群体A）；类群Ⅲ中有30 份材料，包括汾豆95、冀豆17、冀10B8 等26 份材料（属群体A）和南圣105、潍豆80031、鲁97013-1、油07-73 四份材料（属群体B）；类群Ⅳ中有17 份材料，包括周01015-1、周豆21、济087129 等14 份材料（属群体B）和中黄37、中黄70、中作4110 三份材料（属群体A）。其中，合交2001-336-7、南圣105、潍豆80031、鲁97013-1、油07-73、中黄37、中黄70 和中作4110 共8 份材料未被归类于原区域类群。

利用NTSYS 对遗传相似度矩阵进行主成分分析（PCA），得出三维立体散点图（图2）。第1、第2和第3 主成分解释变异的贡献率分别为8.255%、5.552%和4.938%，累计贡献率仅为18.745%；聚类法分析（图1）和主成分分析聚类法分析（图2）均可将供试的61 份高油大豆品种（系）划分为4 个类群。进一步证明了供试61 份高油大豆品种（系）间遗传相似度高、遗传背景狭隘以及被分为4 个类群的准确性。

3 结论与讨论

DNA 指纹图谱技术作为最新型的指纹表现手法，在作物血缘关系和遗传基础、品种审定、假冒伪劣种子鉴别、种子管理检测[16⁃17]、遗传育种及作物遗传作图等方面发挥着重要作用。董永梅等[18]以来自黑龙江、内蒙古和新疆的26 份大豆品种为材料，利用8 对SSR 引物将供试材料逐一区分，并构建了26份大豆品种（系）的指纹图谱。丁俊杰等[19]以黑龙江省103 份灰斑病（3 号生理小种）抗性大豆品种为材料，利用与大豆抗灰斑病基因连锁的7 对SSR 引物建立品种的分子身份证。何琳等[20]以长江流域国家大豆区域试验中的45 份大豆品种为材料，选择6对SSR 引物将参试大豆品种全部区分，并获得唯一的分子身份证。然而，关于高油大豆种质资源的遗传多样性分析和指纹图谱构建方面的研究较少。本研究筛选出的7 对核心引物（sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631 和satt268）可将61份高油大豆品种（系）完全区分，且所有材料都有一组唯一的指纹图谱“0/1”代码。利用指纹图谱信息可鉴定出高油大豆的优良基因或DNA 片段在杂交后代中的变化和传递情况，对高油大豆品种的选育具有重要意义。但本研究中供试材料仅为国家大豆区域试验中部分高油材料，缺乏对高油大豆“核心种质”指纹图谱背景的深入研究，因此，其研究结果的广适性有待验证。

通过对作物群体遗传多样性的分析，可进一步了解群体的遗传结构、变异水平和遗传背景，为亲本选配、品种保护等提供理论基础[21]。本研究从均匀分布于大豆20 个连锁群上选取多态性高的SSR标记引物对61 份高油大豆材料的DNA 进行扩增，结果显示，61份高油大豆材料遗传多样性丰富（Na=1.980 3、Ne=1.414 2、H=0.272 4、I=0.429 7、PPB=98.03%）。根据品种（系）产地来源及种植生态区划分的3 个群体中，群体A 材料主要来源于北方春大豆区以及黄淮海夏大豆中部和北部片区，遗传多样性最高，群体B 材料主要来源于黄淮海夏大豆南部片区和长江流域夏大豆区，遗传多样性次之，群体C材料主要是美国引进高油大豆材料，遗传多样性最差。众所周知，栽培大豆起源于我国黄河中下游地区，大豆起源地种质资源相对丰富；而且我国大豆油分含量由北向南总体呈现由高到低的变化趋势[22]。因此，我国大豆种质资源整体上比美国大豆种质资源丰富，大部分高油大豆种质广泛集中于我国北方地区。本研究中，3个群体样本量不同，从某种程度上会影响对其遗传多样性丰富度的判断，下一步需对更丰富的大豆高油材料进行深入研究。

本研究结果表明，3 个高油大豆群体间差异较小、存在低度分化，群体间基因交流较丰富。总体来看，3个群体遗传相似性高、遗传距离较近。宋喜娥等[23]表示，近代我国育成的大豆新品种群体遗传基础越来越窄，育成品种群体遗传背景逐渐单一。BURNHAM 等[24]和GEORGE 等[25]研究也发现，中国和美国大豆亲缘关系较近。本研究结果表明，群体B 与群体C 亲缘关系相对较远，群体A 与群体C 亲缘关系次之。采用国内遗传距离较远或者引进国外高油大豆品种对现有高油大豆品种进行改良，在一定程度上对高油大豆的培育具有积极作用。

种质材料遗传关系受种质材料育种来源地或种植地理位置的影响，通常来自同一地区或生态区的种质材料具有相似的遗传信息，在聚类分析中被聚在相同的类群中[26]。本研究利用NTSYS 进行聚类分析，将61 份高油大豆品种（系）区分为四大类群，各类群中绝大多数的品种（系）来自于同一区域，仅有8份材料未被归类于原区域类群，可能是由于种质资源间存在频繁交流，从而使这些品种（系）与相邻区域大豆品种（系）密切相关。

综上所述，本研究确定了61 份高油大豆品种（系）的亲缘关系，并构建了由7 对SSR 核心引物确定的指纹图谱，为选择遗传背景差异较大、遗传距离较远、可能含有不同高油基因的大豆品种作为亲本材料，培育超高油大豆品种提供理论依据。