洛龙党参总皂苷提取纯化工艺研究

张梅丽，谢卓良，宋亚会，辛庆燕，余 兰

（遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563099）

党参来源于桔梗科植物党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）属的干燥根，其性味甘，性平，可用于脾肺气虚、食少倦怠、气血不足等症状的治疗，是中国传统补中益气的中药材［1，2］。党参的主要成分包括皂苷类、生物碱类、炔类、黄酮类、木质素类、糖类等［3，4］，其中皂苷作为党参的主要功效成分之一，具有明显的抗菌、抗肿瘤、抗炎等药理学活性［5-7］。

目前，皂苷的主要提取方法有超声提取法、微波提取法、回流提取法等［8］。超声波辅助提取法的提取率高，但易破环有效成分的结构，且不适用于大批量工业生产［9］，微波提取法则存在设备成本大以及产品回收率低等缺点［10］，回流提取法可以减少溶剂的消耗，提高浸出效率，同时有利于对皂苷成分的保护，广泛用于工业大规模的生产。皂苷的提取伴随多种化学物质的浸出，所以需要对皂苷进行纯化，其常用方法有大孔树脂吸附法、离子沉淀法和膜过滤法，其中大孔吸附树脂以纯化效率高、选择性高、可循环再生使用等特点被广泛应用于皂苷的纯化［11，12］。

洛龙党参是川党参（Codonopsis tanshenOliv.）的生态型变种，以肉质根条肥大、无硬心出名，可入药或食用，是贵州省道真县特有的党参食用品种［13，14］，但由于对洛龙党参的研究开发起步较晚，目前缺乏对洛龙党参营养成分的基础性研究，如果能有效利用洛龙党参中的功能性成分，则可以创造更高的经济和社会效益，将很大程度上推动当地的发展。本试验以洛龙党参为原料，通过正交优化乙醇回流提取皂苷工艺参数，并采用大孔树脂对总皂苷进行纯化，旨在为洛龙党参功能性成分的深度开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

洛龙党参购自贵州省遵义市道真县洛龙镇，经遵义医科大学药学院杨建文教授鉴定为桔梗科植物川党参（Codonopsis tanshenOliv.）；洛龙党参粉由实验室自制，过65目筛。人参皂苷Re标准品（中国食品药品检定研究院，批号110754-201123）；D101、HPD-100、SA-1、AB-8型大孔树脂（郑州和成新材料科技有限公司）；乙醇、正丁醇、甲醇、高氯酸、冰醋酸香草醛均为分析纯（成都金山化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

FA2004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；HH-St二列六孔水浴锅（郑州长城科技贸有限公司）；RE-2000B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-ⅢG型循环水式多用真空泵（郑州长城科技工贸有限公司）；79CS型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 洛龙党参总皂苷含量的测定方法 采用高氯酸-冰醋酸法［15］测定。精密称取人参皂苷Re对照品2.50 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，量取配置好的对照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分别置于具塞干燥试管中，水浴蒸干，加入现配的5%香草醛-冰醋酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，充分混匀，置于60℃恒温水浴中加热15 min，放入冰水浴中冷却5 min，最后加5 mL冰醋酸终止反应，摇匀，以空白试剂作对照，于最大吸收波长540 nm处测其吸光度，分别以浓度、吸光度为横、纵坐标，得标准曲线。

精密称取干燥洛龙党参5.00 g，置于150 mL圆底烧瓶，加入一定量浓度的乙醇溶液混合均匀后，在一定温度下回流提取一定时间，过滤，提取2次，合并滤液并浓缩，蒸馏水稀释后用等体积饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，减压浓缩后用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中。精密吸取待测样品溶液50μL，置于具塞干燥试管，待水浴蒸干后，按标准曲线的方法测定，于540 nm测量吸光度。

1.3.2 单因素试验 在料液比1∶20，乙醇浓度70%，提取时间90 min的条件下，分别考察提取温度50、60、70、80、90℃对洛龙党参总皂苷提取率的影响；在提取温度70℃，乙醇浓度70%，提取时间90 min的条件下，分别考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30对洛龙党参总皂苷提取率的影响；在提取温度70℃，提取时间90 min，料液比1∶25的条件下，分别考察乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%对洛龙党参总皂苷提取率的影响；在提取温度70℃，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，分别考察提取时间30、60、90、120、150 min对洛龙党参总皂苷提取率的影响。

1.3.3 正交试验设计 在单因素试验基础上，以洛龙党参总皂苷提取率为指标，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个影响因素进行L9（34）正交试验，优化提取参数，正交试验水平设计见表1。

表1 正交因素水平

1.3.4 洛龙党参总皂苷的纯化方法

1）大孔树脂预处理：取适量的不同型号的大孔树脂置于烧杯中，加入95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后湿法装柱，用95%乙醇冲洗大孔树脂至流出液与水混合后无白色混浊，再用去离子水冲洗至流出液无醇味，备用［16］。

2）大孔树脂型号的选择：量取已经预处理后的D101、AB-8、HPD-100和SA-1型大孔树脂各1 g置于具塞锥形瓶中，分别加入相同质量浓度的洛龙党参总皂苷提取液10 mL，于室温下振摇5 h使其达到饱和吸附，然后取出静置，过滤，收集滤液于10 mL容量瓶中定容至刻度。吸附量和吸附率的计算公式如下：

式中，Qe为吸附量，mg/g；Q2为吸附率，%；C0为总皂苷初始质量浓度，mg/mL；Ce为吸附平衡质量浓度，mg/mL；Vi为样品体积，mL；W为大孔树脂质量，g。

将过滤后的大孔吸附树脂分别加入90%乙醇20 mL，于室温下振摇2 h使其充分解吸，取出，过滤，收集滤液于25 mL容量瓶中定容至刻度。解吸量和解吸率的计算公式如下：

式中，Qd为解吸量，mg/g；D为解吸率，%；Cd为解吸液中总皂苷质量浓度，mg/mL；Vd为解吸液体积，mL。

根据静态吸附试验所得结果，筛选出最适合洛龙党参总皂苷纯化的大孔吸附树脂，并将洛龙党参总皂苷配置成2 mg/mL粗提液，按照2 BV/h流速上柱吸附，每1 BV收集一份流出液，共收集10份，测定相应吸光度，根据得到的数据作泄露曲线。

3）上样液浓度对吸附效果的影响：分别精密配置洛龙党参总皂苷粗提液浓度2.00、3.50、5.00、6.50、8.00 mg/mL，按2 BV/h的流速上柱吸附，分别考察不同粗提液浓度对吸附效果的影响，收集树脂柱洗脱液，浓缩，于10 mL容量瓶中定容，测定吸光值，计算吸附量。

4）不同乙醇浓度对洗脱效果的影响：取已经预处理的大孔吸附树脂装柱，上样液浓度为5 mg/mL，以2 BV/h流速上柱吸附，待样品被树脂充分吸附后，以2 BV/h的流速5 BV水洗柱，再分别用0、20%、50%、70%、90%乙醇进行洗脱，比较不同乙醇浓度对洗脱效果的影响。每个浓度各洗脱5 BV，收集后定容于25 mL容量瓶，测定吸光值，计算洗脱率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对总皂苷提取率的影响 由图1可知，当提取温度为50～70℃时，总皂苷提取率呈上升趋势，70～80℃时上升趋势较缓，超过80℃后提取率开始下降。当提取温度为80℃时提取液色素较高，温度耗能太大，在实际生产中易造成成本的增加，且温度过高也会导致部分皂苷性成分的分解，综合考虑，选取70℃为最佳提取温度。

图1 不同提取温度对总皂苷提取率的影响

2.1.2 料液比对总皂苷提取率的影响 由图2可知，随料液比的增加，总皂苷提取率整体呈现上升趋势，当料液比1∶20时上升趋势开始放缓，考虑到溶剂用量过多会导致成本增加，因此选取1∶25为最佳料液比。

图2 不同料液比对总皂苷提取率的影响

2.1.3 提取时间对总皂苷提取率的影响 由图3可知，随提取时间增加，总皂苷提取率呈先上升后下降的趋势，当提取时间达到90 min时提取率最高，随后缓慢下降，原因可能是随着提取时间的延长，杂质的溶出度增加，致使总皂苷的提取率降低，因此选取90 min为最佳提取时间。

图3 不同提取时间对总皂苷提取率的影响

2.1.4 乙醇浓度对总皂苷提取率的影响 由图4可知，当乙醇浓度为50%～70%时，总皂苷提取率上升幅度明显，但当乙醇浓度为70%～90%时，提取率增加趋势减缓。考虑到实际生产成本问题，选取70%乙醇浓度为最佳提取浓度。

图4 不同乙醇浓度对总皂苷提取率的影响

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交试验与方差分析结果 由表2可知，洛龙党参总皂苷回流提取试验影响因素大小的顺序依次为提取时间、料液比、提取温度、乙醇浓度，最佳组合因素为A1B2C2D2，即在乙醇浓度70%，料液比1∶25，提取温度70℃，提取时间90 min的条件下，提取率最高，达到2.15%，经方差分析（表3），提取时间和料液比对洛龙党参总皂苷提取率的影响达到了显著水平，其他因素不显著。

表2 正交试验结果

表3 正交方差分析

2.2.2 正交工艺验证 精密称取干燥洛龙党参5.00 g，按正交优化后的工艺乙醇回流提取洛龙党参总皂苷3次，提取率分别为2.11%、2.19%、2.15%，平均值为2.15%，表明该组合工艺条件下提取皂苷的结果准确可靠。

2.3 大孔树脂静态吸附与动态吸附试验结果

2.3.1 静态吸附试验结果 比较D101、AB-8、HPD-100、SA-1型4种不同性质的大孔树脂的吸附率和洗脱率，由表4可知，HPD-100型大孔树脂吸附率是最高的，SA-1型大孔树脂洗脱率最高，综合吸附率和洗脱率结果，选择HPD-100型大孔树脂用于洛龙党参总皂苷的纯化。

表4 不同大孔树脂的静态吸附与洗脱性能比较

2.3.2 泄露曲线的绘制 由图5可知，当上样量为6 BV时，泄露的总皂苷浓度为0.21 mg/mL，约达上样液浓度的10%，因此选择上样体积6 BV。

图5 泄露曲线

2.3.3 上样液浓度对吸附效果的影响 由图6可知，随着上样液浓度的增大，树脂吸附饱和，吸附率逐渐降低，可能因为药液中有一定的脂溶性成分，当浓度过高时，会堵塞树脂柱，从而影响吸附效果。但样品浓度过低，不利于工业化生产。因此，洛龙党参总皂苷的上样液浓度采用5.00 mg/mL为宜。

图6 上样液浓度对吸附率的影响

2.3.4 洗脱剂浓度对洗脱效果的影响 由图7可知，乙醇浓度在50%～70%时与洗脱率呈正相关，70%乙醇浓度时洗脱率最高，因此选用70%的乙醇溶液作为洗脱剂。

图7 乙醇浓度对洗脱率的影响

2.3.5 洛龙党参总皂苷纯化验证试验 按上述所得的最佳纯化条件进行验证试验，可得总皂苷的洗脱率分别为80.91%、85.96%、82.68%，纯度分别为88.21%、93.72%、90.14%，平均纯度为90.69%，结果表明该条件下纯化洛龙党参总皂苷的重复性好，该方法稳定可靠。

3 小结

本试验通过单因素试验和正交试验设计，得到乙醇回流提取洛龙党参总皂苷的最佳提取工艺条件为：提取温度70℃，料液比1∶25，乙醇浓度70%，提取时间90 min，并在此基础上，通过比较D101、AB-8、HPD-100、SA-1型4种大孔树脂的吸附性能，筛选出HPD-100型大孔吸附树脂作为进一步研究的对象，并确立其纯化工艺条件为：上样液浓度5.00 mg/mL，洗脱剂为70%乙醇，纯化后样品的纯度为90.69%，该提取纯化方法操作步骤简单，纯化效果好，材料经济，适用于工业的大批量生产，为洛龙党参营养物质的深度开发奠定了基础。