不同方法提取川芎挥发油化学成分及抗氧化活性的比较

夏珊，李生茂，张馨予，鲁琴芮，李倩茹，敖慧

(1.川北医学院药学院·川北医学院药物研究所，四川 南充 637000；2.成都中医药大学，四川 成都 611137)

川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎，有活血行气、祛风止痛的功效[1]。研究[2-6]发现，挥发油是川芎的主要药效物质基础之一，主要含有以藁本内酯等为代表的苯酞类、烯萜醇类及脂肪酸类等成分，有镇静、解热、镇痛、改善血液流变、抗氧化、降血压、抗抑郁及抗缺血再灌注损伤等药理活性，其中抗氧化是对抗脑缺血再灌注损伤的药理作用机制之一[7-9]。目前，对川芎挥发油提取方法的研究主要有超临界流体萃取法、水蒸气蒸馏法、石油醚提取法、中性乙醇提取法、蒸馏-萃取耦合法和提取-共沸精馏耦合法等[10-11]，但多集中于比较不同方法提取的川芎挥发油的化学成分差异，而对提取成分抗氧化活性差异的研究较少。本研究旨在比较水蒸气蒸馏法(steam distillation，SD)、以石油醚为溶剂的索氏提取法(soxhlet extraction，SE)和超临界CO2萃取法(supercritical CO2extraction，SFE-CO2)提取的川芎挥发油的化学成分及抗氧化活性的差异，为进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

川芎药材购于成都五块石中药材批发市场，并经川北医学院李毅主任中药师鉴定为伞形科植物川芎(Ligusticum Chuanxiong)的干燥根茎。1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylphenylhydrazine，DPPH，美国sigma公司)、正己烷(国药集团化学试剂有限公司)、无水硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司)、甲醇(成都市科龙化工试剂厂)和石油醚(成都市科龙化工试剂厂)均为分析纯。Ohaus Discovery 1/100 000电子分析天平购于奥豪斯仪器(上海)有限公司，Epoch 微孔板分光光度计购于美国BIOTEK 公司，Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪购于美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 川芎挥发油的提取 取川芎粗粉过20目筛后提取。(1)SD[12]：取约200 g，置于2 000 mL圆底烧瓶中，加入1 200 mL蒸馏水，按《中国药典》2015年版一部挥发油测定法(附录XD甲法)进行，水蒸气蒸馏5 h，收集挥发油。(2)SE[13]：取约20 g，置于索氏提取器，加入200 mL石油醚(60～90℃)，提取3 h，滤过，滤液减压浓缩，收集挥发油。(3)SFE-CO2[14]：取约30 g，于萃取斧温度44℃、压力4 000 PSI下萃取1 h，收集挥发油。

1.2.2 川芎挥发油化学成分及相对含量测定 取提取的川芎挥发油样品，加正己烷稀释，用无水硫酸钠除去水分，0.22 μm微孔滤膜过滤；气相色谱-质谱法(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)分析测定(GC条件：载气为氦气；体积流量1.0 mL/min；程序升温，初始温度50℃，保持2 min；10℃/min速率升至120℃，保持8 min；5℃/min速率升至180 ℃，保持8 min；20℃/min速率升至260℃，保持4 min，分流进样，分流比：分流比1∶60；进样量1 μL；进样口温度280℃)川芎挥发油的总离子流图，通过工作站 NIST 标准质谱图库检索并结合文献报道[15-17]，确定各色谱峰代表的化学成分，并按面积归一化法计算各成分在挥发油中的相对含量。

1.2.3 川芎挥发油抗氧化活性检测 通过测定川芎挥发油对DPPH自由基的清除率检测其抗氧化活性[18-19]：称取适量DPPH加甲醇配制成170 μmol/L的溶液，避光保存。取川芎挥发油样品适量，加甲醇溶解并稀释成一定浓度的供试品溶液，并取0.15 mL与0.15 mL DPPH溶液置96孔板，混匀后室温避光放置60 min，517 nm处测定吸收度A1；同时测定0.15 mL供试品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2。DPPH自由基清除率=[1-(A1-A0)/A2]×100%。以清除率(Y)对药物浓度(x)进行回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时药物的浓度(IC50)。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 川芎挥发油的化学成分

SD提取的川芎挥发油，检测到44个色谱峰，鉴定其中32个色谱峰的峰面积之和占总峰面积的93.74%。其中，Z-藁本内酯相对含量最高，占53.71%，其次是川芎内酯(13.94%)、丁基苯酞内酯(6.77%)、丁基苯酞(3.58%)和β-Selinene(2.97%)。在鉴定的化合物类型中，内酯类(苯酞类)5个，峰面积之和占总峰面积的79.13%；烯类12个，占6.54%；酮类1个，占0.90%；醇类6个，占4.10%；酚类3个，占1.92%；脂肪酸及其酯类1个，占0.10%；其他类4个，占1.05%。SE提取的川芎挥发油检测到23个色谱峰，鉴定其中18个色谱峰的峰面积之和占总峰面积的96.61%。其中，Z-藁本内酯相对含量最高，占43.43%，其次是川芎内酯(22.39%)、亚油酸(15.74%)、丁基苯酞内酯(3.38%)、丁基苯酞(2.88%)。在鉴定的化合物类型中，内酯类(苯酞类)6个，占74.08%；烯类5个，占3.56%；酚类1个，占0.68%；醇类2个，占0.59%；脂肪酸及其酯类2个，占16.13%；酰胺类1个，占1.42%；酮类1个，占0.15%。SFE-CO2提取的川芎挥发油检测到30个色谱峰，鉴定其中21个色谱峰的峰面积之和占总峰面积的94.44%。其中，Z-藁本内酯相对含量最高，占46.93%，其次是川芎内酯(23.40%)、亚油酸(6.93%)、丁基苯酞内酯(4.49%)、丁基苯酞(4.10%)。在鉴定的化合物类型中，内酯类(苯酞类)5个，占80.13%；烯类7个，占4.32%；醇类2个，占0.69%；酚类1个，占0.25%；脂肪酸及其酯类6个，占9.05%。SD、SE及SFE-CO2提取的川芎挥发油有10个共有成分，分别为4-萜烯醇、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、β-Selinene、Espatulenol、丁基苯酞、丁基苯酞内酯、川芎内酯、Z-藁本内酯、E-藁本内酯和亚油酸甲酯，其中Z-藁本内酯含量最高，分别为53.71%、43.43%和46.93%；10个共有成分相对含量之和分别为87.17%、76.58%和83.40%，且均以苯酞类为主，相对含量分别为79.13%、74.08%和80.13%。见表1、图1及图2。

表1 三种方法提取的川芎挥发油成分

2.2 川芎挥发油的PCA

表2 PCA特征值及累积方差贡献率

2.3 川芎挥发油的抗氧化活性

SD、SE及SFE-CO2提取的川芎挥发油对 DPPH自由基均有一定的清除作用，且清除率与剂量有依赖关系。对数回归方程分别为YSD=0.2495ln(x)+0.9001，R2=0.9243、YSE=0.3186ln(x)+0.7772，R2=0.9962、YSFE-CO2=0.2585ln(x)+0.519，R2=0.9779；IC50值分别为0.20 mg/mL、0.42 mg/mL、0.93 mg/mL；三种方法提取川芎挥发油清除DPPH自由基的能力大小依次为SD>SE>SFE-CO2。见图4。

3 讨论

SD利用挥发油难溶于水且沸点较低，可随水蒸气蒸出来的原理提取，具有设备简单、容易操作、成本较低等优点，是提取挥发油的经典方法之一，但易破坏热敏性成分，且能耗较大。SE利用挥发油易溶于石油醚、乙醇、正己烷、乙醚、丙酮等有机溶剂的原理，通过有机溶剂减压浓缩回收得到挥发油成分，耗能小、工艺简单，且挥发油得率相对较高，但所得挥发油多含有植物蜡、色素、脂肪等杂质，并存在提取时间长、溶剂使用量大、回收困难等不足。SFE-CO2是最近三十多年快速发展起来的一种提取挥发油的方法，具有提取温度低、效率高、不破坏热敏成分及无溶剂残留等优势，但所需设备价格贵、运行成本高[22-24]。

本研究采用GC-MS分析比较SD、SE和SFE-CO2提取的川芎挥发油，结果显示，SD提取的川芎挥发油中化学成分数量相对最多，为44个，SFE-CO2次之，为30个，SE相对最少，为23个。在鉴定的化学成分中，三种方法提取的川芎挥发油有10个共有成分，共有成分相对含量之和分别达87.17%(SD)、76.58%(SE)和83.40%(SFE-CO2)，且均以苯酞类化学成分为主，相对含量分别为79.13%、74.08%和80.13%，表明这三种方法提取的川芎挥发油主要化学成分相似，仅相对含量有所不相同。除共有成分外，不同方法提取的挥发油的化学成分种类也有一些差异。其中，SD提取的川芎挥发油烯类成分较多，如α-蒎烯、萜品油烯、γ-萜品烯、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene、α-松油醇、β-Elemene、Tetradecamethylcycloheptasiloxane、β-Cadinene、Neoisolongifolene、γ-Selinene、1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene、15-Copaenol、(-)-蓝桉醇和角鲨烯等。而SE及SFE-CO2提取的挥发油中亚油酸等脂肪酸类较多，与文献报道[12,15-17]基本一致。

PCA结果显示，SE和SFE-CO2提取川芎挥发油化学成分较为相似，与SD差异相对较大。三种方法提取的川芎挥发油均具有一定的抗氧化活性，其清除DPPH自由基活性的大小顺序依次为SD>SE> SFE-CO2，可能与SD提取的川芎挥发油中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、α-蒎烯[25]、α-松油醇、γ-萜品烯[26]和角鲨烯[19]等具有较强清除DPPH自由基活性的成分有关。但川芎挥发油抗氧化的活性成分还有待进一步研究。

综上所述，SD、SE和SFE-CO2提取的川芎挥发油化学成分的种类、数量和抗氧化活性存在一定差异，但主要化学成分相似，仅相对含量有所不同。