hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在原发性痛风中的变化及临床意义

戴菲，何怡曦，唐乙萍，董曾荣，周闻君，张全波，青玉凤

(川北医学院附属医院，1.高尿酸血症与痛风研究中心；2.风湿免疫科；3.老年科，四川 南充 637000)

痛风是机体嘌呤代谢障碍引起组织损伤的一组临床综合征，主要表现有高尿酸血症、关节炎、痛风石、关节畸形、泌尿系结石及肾脏实质性病变等[1]。流行病学研究[2]显示，痛风患病率逐年上升，因评估方法不同，全球各地患病率1%～6.8%。目前痛风的具体发病机制尚不清楚。研究[1-4]发现，遗传、免疫、环境因素以及饮食习惯等不同程度参与了痛风的发生发展。血清尿酸(serum uric acid,sUA)水平升高被认为是痛风发生的重要危险因素，研究[5]提示只有约10%的高尿酸血症患者最终发展为痛风。同时，痛风患者容易并发糖尿病、高血压、高血脂、心脑血管等疾病，对人体健康造成严重威胁。因此，阐明痛风的确切发病机理及找寻原发性痛风的早期诊断生物标记物，为早期诊断及治疗痛风提供有力的证据尤为重要。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型非编码RNA，具有闭合环状结构，广泛且多样地存在于真核细胞中[6]。在肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等发生发展中起着重要作用[7-9]，但在痛风中鲜有相关报道。为此，我们前期收集痛风患者及健康对照者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)行circRNA微阵列表达谱检测，发现痛风中有多个异常表达的circRNA[10]。本研究选取其中在急性痛风患者中显著高表达的hsa_circRNA_104633和显著低表达的hsa_circRNA_406281两个基因，扩大样本量进行实时荧光定量多聚合酶链反应(quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)实验，检测其在大样本不同分期痛风患者中的表达情况，初步探讨hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在原发性痛风中的差异表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年4月至2021年3月川北医学院附属医院风湿免疫科就诊的90例男性痛风患者作为研究对象，其中急性期痛风(active gout，AG)和间歇期痛风(inactive gout，IG)患者各45例，平均年龄分别为(42.00±13.50)岁和(43.00±20.00)岁，所有痛风患者均符合2015年ACR/EULAR制定的痛风诊断标准[11]，且排除肾脏原发疾病、肿瘤、药物等所致继发性痛风者。此外，AG患者出现关节肿胀、发热、疼痛等症状不超过1周；IG患者至少有两周没有关节症状，并且炎症指标，如红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、白细胞计数(white blood cell count，WBC)等在正常范围内。另选择同期到川北医学院附属医院体检中心进行体检的健康男性60例作为对照组(healthy controls,HC)，平均年龄为(43.50±17.75)岁，其实验室指标均在正常范围，且无痛风病史及其他自身免疫性疾病、代谢性疾病等病史。三组研究对象年龄差异无统计学意义(P>0.05)。该研究获得了川北医学院附属医院伦理委员会批准，且所有参与者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实验室常规指标的收集 采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血4 mL,于LH750血细胞分析仪及DxC800全自动生化仪(美国Beckman公司)检测sUA、空腹血糖(fasting blood glucose，GLU)、炎症及脂质代谢指标水平。其中炎症指标包括ESR，CRP，WBC，中性粒细胞粒计数(neutrophil granule count，GR)，淋巴细胞计数(lymphocyte count，LY)，单核细胞计数(monocyte count，Mo)；脂质代谢指标包括血浆总胆固醇(plasma total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglycerides，TG)，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)，极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)。上述所有指标为受试者就诊时的常规检查，且均在川北医学院附属医院临床检验科进行。

1.2.2 hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281检测 采用qRT-PCR法：收集所有研究对象肝素钠抗凝的外周静脉血2～3 mL，淋巴细胞分离液分离出PMBCs，根据Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书提取总RNA。采用紫外分光光度仪测定总RNA浓度及纯度，选取吸光度值(A)260/280为1.8～2.0的标本，并以1‰DEPC水调整总RNA浓度至300 ng/mL。根据逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书，取2μL总RNA逆转录成cDNA。然后在LightCycle®96PCR仪(瑞士Roche公司)上进行PCR反应，反应总体积为10 μL。包括5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，3.6ul ddH20，上下游引物各0.2 μL，1μL cDNA。以两步法扩增，第一步：95℃ 30 s 1个循环→[95℃ 5 s→60℃ 34 s]40个循环。第二步：95℃ 15 s→60 60 s→95℃ 15 s 1个循环。本研究以β-actin作为内参基因，所有PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成，β-actin上游引物序列：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物序列：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′，扩增片段大小120bp；hsa_circRNA_104633上游引物序列：5′-AGTAACTGCTCCCCCTGAGGA-3′,下游引物序列：5′-GGGACTGCTGGCTCTGAAGT-3′，扩增片段大小180bp；hsa_circRNA_406281上游引物序列：5′-ACTGATGATGGAGGCTTCAGTGA-3′，下游引物序列：5′-TCTGCTTGGACACTGAAGGTTGA-3′，扩增片段大小170bp。每份标本均设2个复孔，反应结束后作溶解曲线。以2-△C(t)作为circRNA的相对表达水平来分析不同样本间circRNA的差异表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 三组研究对象临床特点及主要实验室指标比较

三组对象年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。痛风组(AG+IG)的炎症指标如CRP、ESR、WBC、GR以及代谢指标如sUA、GLU、部分血脂相关指标等高于HC组(P<0.05)。AG组CRP、ESR、WBC、GR、Mo高于IG组(P<0.05)，两组代谢指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。此外，在IG组中，虽然所有炎症指标均在正常范围，但在正常范围内的WBC、GR、Mo数值均较正常HC组高(P<0.05)。见表1。

表1 三组研究对象的临床特点及实验室指标比较

2.2 三组研究对象hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281的表达水平比较

hsa_circRNA_104633在AG及IG组中的表达均高于HC组(P<0.005)，但AG与IG组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；hsa_circRNA_406281在AG组中的表达高于IG及HC组(P<0.05)，但IG与HC比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 通风患者hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281基因表达水平与实验室指标的关系

相关系分析显示，hsa_circRNA_104633与sUA成正相关(r=0.305，P=0.003)，hsa_circRNA_406281与CRP、sUA呈负相关(CRP：r=-0.513，P<0.001；sUA：r=-0.213，P=0.043)。见表2。

表2 痛风患者hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281的表达水平与实验室指标的相关性

2.4 hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281对痛风的诊断价值

ROC曲线显示，hsa_circRNA_104633诊断痛风的AUC为0.822(95%CI：0.756～0.888；P<0.001；敏感性=76.70%；特异性=78.30%)，与hsa_circRNA_406281比较，差异无统计学意义(P>0.05)。考虑hsa_circRNA_406281在AG组的表达高于IG与HC组，推测其可能参与了急性痛风的炎症反应，成为痛风潜在的炎症标志物，故对其进行ROC曲线分析发现其AUC值为0.667(95%CI：0.576-0.759；P=0.001；敏感性为51.90%；特异性为84.10%)。见图2。

3 讨论

CircRNA可以充当miRNA海绵，影响蛋白质翻译，或与RNA结合蛋白相互作用，调节蛋白质的募集与组装[6]。因此，circRNA的多功能性使其成为研究和预测疾病的理想之选。近年来，越来越多的研究表明，circRNA的失调与多种风湿病的发生发展密切相关，如系统性红斑狼疮[12]、类风湿关节炎[13]、骨关节炎等[14]，但在痛风中鲜有相关报道。本课题组前期通过circRNA微阵列芯片筛选出与健康体检者明显差异表达的两个circRNA分子hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281，通过查阅文献，目前已有研究发现hsa_circRNA_104633可以被高迁移率族蛋白2调节，从而影响肺腺癌生长[15]。此外，关于hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在胃癌、神经母细胞瘤、食管癌、肝脏寄生虫等[16-19]相关疾病的微阵列芯片检测中均有相关报道其差异表达，推测其可能参与了多种疾病的发生发展。本研究扩大样本并通过PCR检测了它们在痛风人群及HC中的相对表达量，发现hsa_circRNA_104633在痛风患者PBMCs的表达显著增高，而hsa_circRNA_406281则显著降低，提示两个circRNA可能在痛风的发病机制中发挥作用。

痛风是一种炎症性疾病，其急性炎症反复发作且可自发缓解的机制是当今痛风炎症机制研究中的热点问题[20]。本研究发现即使间歇期痛风患者炎症指标处于正常范围，但其炎症指标水平仍高于HC组，间接说明了即使在在痛风稳定期，痛风患者体内仍然存在低水平的炎性活动。此外，痛风也是一种代谢性疾病，流行病学调查显示，痛风与高尿酸血症，高脂血症，高血糖等密切相关[3]，sUA水平升高被认为是痛风发生的重要危险因素[1,5]，高尿酸血症是高血压病、冠心病、糖尿病等代谢性疾病的独立危险因素之一。研究发现[1,21-23]尿酸代谢紊乱与脂代谢或者糖代谢可能互为因果，一方面脂肪代谢产生的酮体可阻碍sUA排泄，间接使sUA水平增高，而sUA水平升高可降低脂蛋白酶活性，影响脂质代谢。另一方面，sUA持续升高可损害胰腺B细胞功能，出现胰岛素抵抗，而持续的高血糖状态可使机体出现氧化应激，损伤血管内皮，促使血管平滑肌细胞增殖，可引起肾小球动脉硬化，肾血流量减少，上述过程可导致sUA排泄障碍，使sUA水平增高。而circRNA作为非编码RNA的一种，在调节免疫炎症反应及代谢性疾病中发挥着重要作用：如近期发现，肝脏成纤维细胞中脂质暴露引发的内质网应激导致线粒体中circRNA SCAR表达量下降，原本与其结合的ATP合成酶β5转而与亲环素D蛋白结合，导致线粒体通透性转换孔通道开放，使线粒体中的活性氧自由基释放到胞质中，加重非酒精性脂肪性肝炎[24]；另有研究表明circHIPK3可竞争性结合miR-192-5p从而上调转录因子FOXO1导致高血糖和胰岛素抵抗[25]；Circ_0001103可调控miR-375以及去乙酰化酶1来改善炎症因子IL-1 β诱导的软骨细胞损伤[26]。本研究从炎症、尿酸代谢、脂代谢、糖代谢方面选择上述实验室指标与两个circRNA分子在痛风患者中的相对表达量进行了相关性分析。结果发现hsa_circRNA_104633与sUA成正相关，hsa_circRNA_406281与CRP、sUA呈负相关，提示hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281可能参与痛风患者的尿酸代谢调节，且hsa_circRNA_406281还可能参与了痛风炎症调节，其具体机制有待进一步研究。

随着人们生活水平的提高，痛风已是我们生活中的常见病、多发病。大部分AG患者伴有高尿酸血症，但仍有部分痛风患者sUA水平在正常范围，一项关于221名AG患者的回顾性队列研究中发现约40%的痛风患者急性期无sUA水平的升高[27]。目前在偏振光显微镜下发现MSU晶体仍是诊断痛风的金标准，但是，作为一项有创操作，临床应用很少，特别是对于没有高尿酸血症的痛风患者，MSU的检出率非常低，因此寻找有效的痛风诊断标志物及治疗靶标至关重要。CircRNA具有独特的结构，高稳定性和特定的表达方式，近年来，越来越多的证据表明circRNA可以作为多种疾病的新型诊断标志物，如组织样品中circ-PSD3可能是甲状腺乳头状癌的潜在诊断生物标志物[28]；circFKBP8和circMBNL1在外周血中异常表达可能是诊断重度抑郁症的生物标志物[29]；全血中hsa_circ_0082688和hsa_circ_0082689可作为系统性红斑狼疮的诊断生物标记[12]。然而，目前没有关于使用circRNA作为痛风的生物标志物的报道。体液是诊断多种人类疾病的常用材料，尤其是外周血在诊疗疾病方面具有独特的优势。由于保守的共价闭合的环状结构，circRNA对RNA酶具有较高的抵抗性，使其在体液或外周血中得以富集[6]。在本研究中，痛风组PBMCs中hsa_circRNA_104633的表达水平显著高于HC组。通过ROC曲线进一步分析了它们的诊断价值显示hsa_circRNA_104633的曲线下面积大于0.8，可以很好的将痛风患者和健康人群区分开。这表明hsa_circRNA_104633可能具有作为痛风生物标志物的潜力。但是，需要更大的样本量及不同人群的比较进一步证实我们的结果。

综上，本研究发现hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在痛风患者PBMCs中异常表达，提示其可能参与痛风发病，进一步分析发现hsa_circRNA_104633的表达量与痛风患者血尿酸浓度呈正相关，而hsa_circRNA_406281则与血尿酸浓度呈负相关，提示这两个circRNAs可能参与痛风患者尿酸代谢的调节；同时发现hsa_circRNA_406281的表达量与CRP呈负相关，提示hsa_circRNA_406281可能还与痛风炎症调节密切相关。此外，hsa_circRNA_104633能很好的将痛风患者与HC区分开，在痛风临床诊断和治疗中可能具有潜在的用途。但是本研究也存在一些局限性，未来的研究将通过扩大样本量、设置疾病组对照、进行功能实验等来进一步明确它们在痛风中的分子机制和特定功能。