丙泊酚对大鼠肠缺血-再灌注炎症反应的影响

陈思言，欧刚，陈斌

(川北医学院附属医院麻醉科，四川 南充 637000)

腹部外伤、失血性休克、严重创伤、感染、烧伤可发生肠缺血-再灌注(ischemia reperfusion injury，IRI)损伤[1]。肠IRI不仅可以引起肠道组织局部损害，还可以导致细菌和毒素移位到体循环，产生异常的组织反应，促炎症细胞因子大量释放入血，引发系统性炎症反应综合征，后期可发展为多器官功能衰竭[2]。因此，目前缺血-再灌注损伤的机制，以及如何减轻IRI产生的炎症反应、氧化应激损伤一直是研究热点。在肠缺血-再灌注损伤中炎症细胞因子发挥了重要作用，在肠道组织发生缺血再灌注后，细胞会释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)及IL-6等炎症细胞因子，对受损的细胞组织产生损伤。IL-1和IL-6都具有多种致炎活性，包括白细胞趋化、吞噬细胞刺激、增强下游细胞因子和趋化因子的产生。TNF-α可提高中性粒细胞的吞噬能力，也能促进内皮细胞对IL-1、IL-6的分泌，并能促进中性粒细胞和内皮细胞的黏附作用，从而刺激扩大机体局部炎症反应及组织的损伤[3]。因此，炎性因子在缺血-再灌注过程中的表达水平来反映炎症反应的强烈程度，同时也反映出缺血-再灌注损伤的严重程度。丙泊酚具有麻醉诱导快和恢复迅速的特点，是外科手术麻醉的基本药物。丙泊酚的化学结构与天然抗氧化剂维生素E的结构类似，能抑制氧自由基的产生或拮抗其氧化效应，对缺血-再灌注损伤有预防或治疗作用[4]，但丙泊酚对肠缺血-再灌注的炎症反应有何影响，尚未见临床报道。本研究拟构建大鼠肠缺血-再灌注损伤模型，使用丙泊酚预处理，观察对肠组织病理形态学改变，Chiu氏评分[5]及对IL-1、IL-6、TNF-α含量的影响，探讨丙泊酚是否对大鼠肠缺血-再灌注损伤有预防或治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性SPF级SD大鼠40只，体重(220±30)g，购于川北医学院动物实验中心。术前禁食12 h，自由饮水。本研究已通过川北医学院伦理委员会审查，批号为NSMC伦理动物审[2021]01号。

1.2 方法

1.2.1 动物模型创建 参考Wang等[6]的实验方法建立肠IRI模型。术前大鼠禁食12 h，自由饮水，给予3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔内注射麻醉，待麻醉生效后，将大鼠仰卧位固定于解剖板上，常规手术区域消毒铺巾，取腹正中切口2.0～3.0 cm，用37℃左右无菌生理盐水纱布保护切口，分离肠系膜动脉，以无创微动脉夹夹闭肠系膜动脉(SMA)根部，可见肠系膜动脉搏动消失，结肠组织颜色由鲜红变苍白，表明SMA成功阻断，缝合切口，1h后原切口进腹，移走动脉夹，恢复血流实施再灌注，肉眼可见肠系膜动脉搏动恢复，结肠组织颜色由暗红变为鲜红。术中用白炽灯加热保温，维持直肠温度36～38℃，每隔30 min观察大鼠结肠组织血供情况。

1.2.2 实验分组 采用随机数字表法，将40只大鼠随机分为假手术组(S组)、肠I/R损伤(I/R组)、丙泊酚预处理组(P组)和NS预处理组(NS组)，每组各10只。S组和I/R组实验开始前连续3 d腹腔既不注射丙泊酚也不注射生理盐水，实验开始时，S组仅分离肠系膜上动脉而不夹闭，I/R组分离肠系膜上动脉后夹闭1 h，再灌注2 h；P组于实验前每天18∶00点腹腔注射丙泊酚50 mg/kg，连续3 d；实验开始时分离肠系膜上动脉夹闭1 h，再灌注2 h；NS组于实验前同一时间点腹腔注射等容积0.9%生理盐水，实验开始时操作同P组。

1.2.3 标本处理 恢复正常血液灌注2 h时处死大鼠，打开腹腔，迅速取出升结肠组织，用装有4℃生理盐水的注射器冲洗肠道内容物，然后纵向剖开肠道，滤纸吸干水分，切3 mm组织进行组织学分析，把肠道卷成瑞士卷样，然后放入活检盒中维持瑞士卷状浸泡入多聚甲醛，其余部分置于-196℃液氮中保存，检测IL-1、IL-6、TNF-α表达水平。

1.2.4 结肠黏膜形态学观察和病理学分析 实验大鼠结肠组织用多聚甲醛溶液固定24 h，而后经乙醇梯度脱水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯透明，石蜡包埋，做成蜡块，用石蜡切片机将包埋好的蜡块切成厚度5 μm连续切片，烤片后进行苏木素/伊红染色，显微镜下观察结肠组织病理学改变情况。每个标本取2个不同切片，每个切片取10个视野取均数(100×)。采用Chiu氏评分法[5]评价肠黏膜损伤程度，0分为正常绒毛；1分为绒毛顶端黏膜下出现间隙，毛细血管充血；2分为黏膜下间隙扩大，肠黏膜与黏膜下层分离；3分为黏膜与黏膜下层分离延伸到肠绒毛两侧；4分为绒毛变钝，固有层及其血管暴露，炎性组织浸润；5分为固有层消化崩解，出血或形成溃疡；分值越高表示组织病变越严重。

1.2.5 炎性细胞因子检测 取约100 mg结肠组织，加入0.9 mL生理盐水制成10%的组织匀浆，采用酶联免疫吸附法(ELISA)按试剂盒(江苏酶联生物科技提供)说明书，检测结肠组织中TNF-α，IL-1、IL-6含量。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被抗体的微孔中依次加入抗原、生物素化的抗大鼠抗体、亲和素过氧化物酶复合物(ABC)，经过彻底洗涤后用底物TMB显色液显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中炎症因子含量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，计算样品浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠结肠组织切片及病理评分比较

光镜下：S组肠黏膜绒毛完整光滑，皮下间隙无扩张、无充血、水肿，未见或极少量炎症细胞浸润；I/R组和NS组肠黏膜绒毛排列不规则，黏膜及黏膜下水肿、出血，炎症细胞渗出；P组肠黏膜充血，间质出血较I/R组轻，黏膜缺损、断裂现象较I/R组有明显改善，腺体结构比较清楚。Chiu氏评分结果显示，I/R组和NS组Chiu氏评分高于S组(P<0.05)，P组高于S组(P<0.05)，但低于I/R组和NS组(P<0.05)。见图1及表1。

表1 各组大鼠结肠Chiu氏评分比较

2.2 结肠组织炎症因子含量比较

与S组相比，I/R组和NS组大鼠结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α的表达升高(P<0.05)；经丙泊酚干预后，P组大鼠结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α的表达均下降，且与I/R组和NS组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 组织炎症因子检测结果比较

3 讨论

本研究通过采用夹闭肠系膜动脉法构建大鼠结肠I/R模型，光镜下可见，I/R组大鼠结肠组织发生明显的I/R损伤(图1)，且Chiu氏病理学损伤评分亦高于S组及NS组(P<0.05)，与Kalogeris等[7]的研究相符，证实造模成功。本研究发现，丙泊酚干预I/R模型大鼠经丙泊酚干预后的P组大鼠结肠组织肉眼和光镜下显示肠壁外观、黏膜缺损/断裂、间质充血和炎症细胞浸润等病理预处变化较I/R组有明显改善，且Chiu氏评分也低于I/R组(P<0.05)，提示丙泊酚理能够有效降低结肠I/R病理损伤。可能的机制[8-14]有：(1)降低炎症因子以及髓过氧化物酶MPO的表达；(2)抑制NADPH氧化酶介导的肥大细胞激活；(3)抑制ROS的过量产生、内质网Ca2+的释放以及线粒体去极化减轻脑缺血再灌注损伤，保护神经系统功能；(4)阻止HIF-Α激活来抑制线粒体功能障碍和氧化应激；(5)BRG-1介导的Nrf/HO-1转录因子的激活，减轻组织羟自由基和超氧阴离子的含量；(7)通过激活Nrf-2通路减轻组织脂质过氧化物丙二醛的积累，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活力。

Ayazi等[15]研究指出，IL-1、IL-6、TNF-α为主要的促炎因子，其在血液循环和局部组织中的过度激活可诱发大量炎症介质释放，降低机体免疫功能，引起强烈的全身性和局部性炎症反应。本研究发现，与S组比较，I/R组和NS组结IL-1、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.05)，故可认为本研究设计的观察指标是合理的。经丙泊酚干预后，P组大鼠结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α的含量较I/R组均降低(P<0.05)，提示丙泊酚预处理可以通过降低结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α含量来减轻大鼠肠缺血再灌注损伤。Idriss等[16]研究也指出，TNF-α是肠缺血再灌注损伤中释放最早、发挥核心作用的一种内源性炎症介质，通过作用于细胞膜上的可溶性受体(TNFR1与TNFR2)，激活凋亡蛋白caspase-8诱导细胞凋亡，NF-κB与相应的DNA启动子区域结合可促进促炎细胞因子。由此我们可推测丙泊酚是否是通过阻止NF-κB与相应的DNA启动子区域的结合来抑制促炎因子的释放，这还需要进一步的实验验证。Fatemeh等[17]研究证明5-HT1B/1D受体参与大鼠肠缺血再灌注炎症反应和氧化应激，我们也可以进一步推测丙泊酚是否能够作用于5-HT1B/1D受体。本研究不足之处在于：(1)未研究不同剂量丙泊酚预处理对大鼠结肠缺血再灌注的影响；(2)未证实丙泊酚腹腔注射是否是最佳药物处理方式；(3)未能观察丙泊酚预处理后大鼠的存活率，以更加有利地说明丙泊酚预处理的有效性。丙泊酚对保护肠I/R损伤作用的其他机制，需要进一步的研究与探索。

综上，丙泊酚腹腔注射预处理能够减轻大鼠结肠I/R病理损伤，同时抑制肠I/R的炎症反应。