Mir-335-5p靶向G6PD对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响*

樊小群， 李 欢， 朱华雄， 黄健平， 何吕芬

(海南省三亚市人民医院检验科， 三亚 572000)

结肠癌是最常见的恶性肿瘤。在全球范围内已90%以上的结肠癌患者死亡[1]，尽管改良的筛查技术和先进的治疗方法有助于提高患者的生存率，但是仍没有一种完善方案的治疗结肠癌[2]。因此亟需探索新型控制结肠癌的治疗策略。近年来越来越多研究发现，抑制肿瘤的代谢途径可有效抑制肿瘤发生，而6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是糖代谢过程重要的酶之一，在肿瘤的生存中发挥重要作用[3]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类小的非编码RNA，通过靶向mRNA降解或翻译抑制来控制基因表达[4]，mir-335-5p作为结肠癌抑制因子的作用已被证实[5]。然而，mir-335-5p在结肠癌细胞中抑制生长增殖、凋亡的机制是否与G6PD相关尚未清楚。本研究通过体外培养结肠癌细胞SW480，探究mir-335-5p过表达对结肠癌细胞SW480增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人结肠癌细胞SW480和结肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IEC)均购自于中国科学院细胞库，miR-335-5p mimic质粒、miR-335-5p NC质粒购自于上海吉凯基因有限公司设计并合成购自于上海吉凯基因(miR-335-5p模拟物序列为5'-UACAGUACUGUGAUAACUG AA-3'，模拟阴性对照(NC)序列为5 '-GTTCTCCGAAAACGTGTCACGT-3')，Lipofectamine 3000(货号L3000001)、PCR试剂盒(货号 14966005)均购自于美国ThermoFisher公司，反转录试剂盒(货号K1622)购自于美国Fermentas公司，Trizol(货号46301)购自于美国Sigma公司，荧光素酶活性检测试剂盒(货号E2920)购自于美国promega公司，荧光素酶报告载体由上汉恒生物公司提供，抗体G6PD(货号ab993)、抗体Bcl-2(货号ab185002)、抗体Bax(货号ab32503)均购自于美国abcom公司，MTT试剂盒(货号M1025 )购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器

酶标仪(型号TECAN spark)购自于帝肯(上海)贸易有限公司，电泳仪(型号1658001)购自于美国Bio-Rad公司。荧光定量PCR仪(型号ABI9700 )购自于美国ABI公司

1.3 细胞培养

人源性结肠癌细胞SW480与正常结肠细胞IEC分别接种于含1%双抗(青霉素和链霉素)，10%FBS 1640培养基中，放置于37℃，5% CO2孵育箱中培养，待细胞融合至80%～90%时，用0.25%的胰蛋白酶常规消化，1 500 r/min离心5 min，弃去上清，制备细胞悬液，接种于无菌细胞培养瓶中进行培养。

1.4 转染及分组

设置正常结肠癌细胞组、空白对照组、NC组、miRNA-335-5p mimic组；取对数生长期的细胞SW480，消化，离心后细胞计数，调整细胞密度为1×106cells/ml，每孔1 ml铺于6孔板，将空白对照组、NC组、miRNA-335-5p mimic组按照Lipofectamine 3000说明书分别用不含血清的培养基稀释pcDNA3.1-NC质粒和pcDNA3.1-miR-335-5p mimic质粒(125 μl)与Lipofectamine 3000混合均匀，对NC组、miRNA-335-5p mimic组细胞进行转染，空白对照组每孔250 μl加无血清的培养基。37℃静置20 min，分别加入6孔板，继续培养6 h，以每孔2 ml更换新鲜完全养基继续培养，每组分别设置6个复孔。

1.5 qRT-PCR检测miR-335-5p、G6PD mRNA相对表达

取培养48 h正常结肠细胞及空白对照组、NC组、miR-335-5p mimic组结肠癌SW480细胞，分别用TrIzol从中提取总RNA，根据引物合成软件Primer Premier 6.0设计引物序列如(表1)所示，用反转录试剂盒对RNA合成cDNA，并扩增，按照定量PCR试剂盒说明书配20μl反应体系，反应条件95℃预变性15 min、95℃变性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40个循环，分别以U6、GAPDH为对照，分析miR-335-5p、G6PD mRNA相对表达水平采用2-△△Ct表示。

Tab. 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.6 双荧光素酶报告基因检测

分别构建含有野生型G6PD 3′-UTR和突变型G6PD 3′-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒(Wt-G6PD 3′-UTR：5'-GGAATTCACCATGGCAGAGCAGGTGGCCCT-3'和Mut-G6PD 3′-UTR：5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATC-3')。收集对数生长期结肠癌细胞SW480，用含10%FBS和1%双抗的培养基调整细胞密度为2×105cells/well，接种于24孔板中，将335-5p mimic或NC分别与Wt-G6PD 3′-UTR质粒和Mut-G6PD 3′-UTR质粒共同转染至共转染至肠癌细胞SW480，每组6个复孔，继续培养48 h。按照荧光素酶活性检测试剂盒操作说明对荧光素酶活性测定。

1.7 MTT法测细胞生长活性

1.4中各组细胞转染后继续培养24 h，在避光条件下每孔分别加入20 μl MTT溶液(浓度5 mg/ml)，放入孵育箱中继续培养4 h后取出，弃去培养基，每孔加入150 μl DMSO放于摇床震荡10 min，待结晶完全溶解后在酶标仪检测570 nm处各孔的OD值。按照相同的方法测定转染后48 h、72 h处各孔的OD值，统计数据分析各组细胞的生长活性情况。细胞生长活性=转染组OD值/对照组OD值×100%。

1.8 流式细胞术测细胞凋亡

1.4中各组细胞转染48 h后，收集细胞，按照Annex-in V-FITC凋亡试剂盒方法在流式细胞仪上检测各组细胞凋亡率。右上象限C2为晚期凋亡细胞，右下象限C4为早期凋亡细胞，细胞凋亡率即为(C2+C4)%。

1.9 Western blot检测G6PD及凋亡相关蛋白表达

1.4中各组细胞转染后培养48 h，每组细胞PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按照4∶1在蛋白中加5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝胶配方表制备12%分离胶和5%浓缩胶，上样量30 μg，上样后进行蛋白凝胶电泳，根据蛋白marker切胶，转膜，加入抗体G6PD，Bax，Bcl-2(均1∶500稀释)孵育，放置4℃过夜，TBST清洗，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1 h，TBST清洗后，参考ECL发光液说明书对条带孵育、曝光、显影。Image J对条带灰度值分析。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 各组细胞中miR-335-5p、G6PD mRNA表达水平的比较

与正常结肠细胞相比，空白对照组、NC组结肠癌细胞SW480细胞中miR-335-5p相对表达水平降低，G6PD mRNA相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组、NC组相比，miR-335-5p mimic组细胞中miR-335-5p相对表达水平显著升高，G6PD mRNA相对表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Relative expression levels of mir-335-5p and G6PD mRNA in cells of each n=6)

2.2 miR-335-5p过表达对SW480细胞增殖能力影响

与空白对照、NC组相比，同一时间miR-335-5p mimic组结肠癌SW480细胞生长活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05, 表3)。

Tab. 3 Effects of over expression of mir-335-5p on proliferative activity of SW480 cells(%, n=6)

2.3 miR-335-5p过表达对SW480细胞凋亡能力的影响

与空白对照(9.21±3.26)%、NC组(10.76± 4.29)%相比，转染48 h后miR-335-5p mimic组 (51.10±6.34)%结肠癌SW480细胞凋亡率显著升高(P<0.05，图1)。

Fig. 1 Flow cytometry results of SW480 cell apoptosis in each group

2.4 miR-335-5p与G6PD存在靶向作用

miR-335-5p mimic+WT-G6PD 3′-UTR组(1.69±0.13)%荧光素酶相对活性低于miR-335-5p NC+WT-G6PD 3′-UTR组(2.47±0.22)%，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-335-5p mimic+MUT-G6PD 3′-UTR组(2.40±0.29)%与miR-335-5p NC+MUT-G6PD 3′-UTR组(2.44±0.33)%比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 miR-335-5p过表达对细胞SW480中G6PD蛋白及凋亡相关蛋白表达的影响

与空白对照组、NC组相比，miR-335-5p mimic组G6PD、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、caspase3蛋白表达水平显著升高(P<0.05，图2，表4)。

Fig. 2 Expressions of G6PD and apoptosis related proteins in SW480 cells by over expression of mir-335-5p

3 讨论

结肠癌是一类发病率和致死率较高的恶性肿瘤，临床上主要是通过手术治疗、放疗和化疗相结合的方法治疗结肠癌[6、7]，但是仍达不到预期的效果，因此研究治疗结肠癌新的靶点成为目前研究热点。研究证实miRNA在肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用。miRNAs是非编码RNA，可与多靶mRNA的3′端非翻译区结合不完全，增强其降解和抑制其翻译功能[8-10]。mir-335-5p是与癌症相关的miRNAs之一，研究发现mir-335-5p由基因组区域染色体7q32.2转录而来，受DNA甲基化的调节，参与细胞分化、细胞周期进程和凋亡的调控表达。本研究发现，与正常结肠细胞相比，mir-335-5p在结肠癌细胞SW480中表达显著降低，提示mir-335-5p在结肠癌细胞SW480中低表达。为进一步研究mir-335-5p在结肠癌中的作用，本实验通过Lipofectamine 3000向结肠癌细胞SW480中转染miR-335-5p mimic，结果发现与空白对照组、NC组相比，miR-335-5p mimic组细胞中miR-335-5p mRNA相对表达水平显著升高，提示在成功建立miR-335-5p过表达模型，可用于下一步实验。

结肠癌细胞SW480具有无限增殖能力，研究发现mir-335-5p表达缺失可导致结肠癌发生，推测mir-335-5p可调控结肠癌细胞SW480细胞增殖活性[11,12]。本研究发现，与空白对照、NC组相比，同一时间miR-335-5p mimic组结肠癌SW480细胞生长活性显著降低，提示miR-335-5p过表达可降低结肠癌细胞SW480生长活性。研究表明mir-335-5p可诱导乳腺癌，胃癌等癌细胞凋亡[13]。Bcl-2是一种抑制细胞凋亡基因，和细胞中促凋亡基因Bax处于一定平衡状态，结肠癌细胞内Bcl-2表达可抑制细胞凋亡，延长细胞生存时间。Caspase-3是线粒体细胞凋亡过程中的一种重要酶，是细胞凋亡过程的重要执行者，其过表达可加速细胞凋亡进程[14,15]。本研究发现，与空白对照、NC组相比，转染48 h后miR-335-5p mimic组结肠癌SW480细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高，提示miR-335-5p过表达能提高结肠癌细胞凋亡率，促使Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，促进结肠癌细胞SW480凋亡。

研究发现miR-335-5p在骨肉瘤细胞、神经胶质瘤和乳腺癌细胞中对细胞增殖的调控作用截然相反[16]，推测不同肿瘤中miR-335-5p调控的靶基因不同，从而激活相应的信号通路对肿瘤细胞产生不同作用。已知G6PD是戊糖磷酸途径中限速酶，为细胞生长增殖提供核糖和NADPH，是维持细胞分裂增殖的重要物质[17]。研究发现G6PD水平在黑色素瘤、白血病和乳腺癌等多种肿瘤中较高[18-20]，许多数据表明G6PD水平升高与结肠癌发生呈正相关。另有研究证实G6PD在肿瘤细胞中表达量高于正常细胞，可为肿瘤细胞提供能量[21]。本研究发现，与正常结肠细胞相比较，结肠癌细胞SW480中G6PD mRNA相对表达水平显著升高，提示，G6PD在结肠癌细胞中高表达。另外，与空白对照组、NC组相比，miR-335-5p mimic组G6PD mRNA和蛋白相对表达水平均降低，提示miR-335-5p过表达可能通过降低G6PD表达影响SW480细胞增殖、凋亡。进一步经由生物信息学网站(http://www.targetscan. org/vert_72/)预测发现，G6PD是miR-335-5p的靶基因之一，双荧光素酶报告基因检测实验显示，WT-miR-335-5p mimic+G6PD 3′-UTR组的荧光素酶相对活性低于WT-miR-335-5p NC+G6PD 3′-UTR组，提示miR-335-5p能够靶向G6PD，调控其表达。

综上所述，上调miR-335-5p可能通过靶向G6PD，抑制结肠癌细胞增殖、诱导结肠癌细胞凋亡，本研究不仅为结肠癌的发生机制研究提供进一步的参考，还在临床治疗或为结肠癌的诊断提供理论依据以及潜在治疗靶点有重要价值。但miR-335-5p可能存在多个靶基因，且结肠癌细胞增殖、凋亡过程较为复杂，其具体作用机制还需进一步研究。

Tab. 4 Overexpression of mir-335-5p on G6PD and apoptosis related proteins in SW480 n=6)