抑制磷脂酰肌醇3激酶/心肌素信号通路对血管平滑肌瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

崔明哲，王 恒，翟水亭，刘 恒，李卫校，徐如涛

河南省人民医院(郑州大学人民医院) 华中阜外医院血管外科 郑州 450003

平滑肌瘤是发生于平滑肌的良性肿瘤，可分为实性平滑肌瘤、上皮样平滑肌母细胞瘤以及血管平滑肌瘤(angiomyoma，AM)3个亚型[1]。其中AM是指发生于皮下或真皮深部的良性肿瘤，是血管平滑肌较为常见的病理变化之一[2]。AM可发生于人体多个组织器官，如子宫、肺、鼻腔、耳廓以及跟腱等[3]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是细胞膜受体酪氨酸激酶的下游介质，近年来，已有大量临床研究[4-5]表明，PI3K与蛋白激酶B相结合可明显抑制肿瘤细胞的增殖。心肌素(myocardin，MYOCD)主要存在于心脏和平滑肌组织，与多种病变密切相关，如心力衰竭、急性血管疾病和糖尿病等[6-7]。PI3K/MYOCD信号通路是近年来新发现的肿瘤抑制信号通路，有研究[8]推测激活该信号通路可能有抑制部分肿瘤细胞增殖的作用。本研究通过检测抑制PI3K/MYOCD信号通路表达的AM细胞增殖和侵袭能力的变化，探讨PI3K/MYOCD信号通路在AM发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与主要试剂AM细胞和DMEM培养基(南京生航生物技术有限公司产品)。Lipofectamine 2000转染试剂(上海赛默飞世尔科技有限公司产品)；PI3K、MYOCD siRNA,PI3K、MYOCD以及内参U6的引物(上海生工生物工程公司产品)；PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白一抗和二抗(英国博欧特公司产品)。PCR检测试剂盒(上海研生实业有限公司产品)、CCK8试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)、Transwell小室(上海艾研生物科技有限公司产品)、Trizol试剂和反转录PCR试剂盒均(美国默克公司产品)、PCR仪及实时荧光定量PCR仪(美国 Bio-Rad公司产品)。

1.2 AM细胞的培养与分组AM细胞应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为3×105个/mL，分别接种至6孔板。培养24 h后将细胞分为2组，每组3个复孔，PI3K/MYOCD siRNA组细胞转染PI3K和MYOCD siRNA，严格按照Lipofectamine 3000转染说明书进行操作，对照组未行转染。

1.3 AM细胞PI3K 、MYOCD mRNA表达的检测采用qRT-PCR进行。采用Trizol提取细胞中的总RNA，使用反转录酶和寡核苷酸合成cDNA。转录反应体系(20 μL)：缓冲液4 μL，反转录酶2 μL，总RNA 2 μL，去RNA酶水12 μL；反应条件：42 ℃水浴1 h，95 ℃水浴5 min。以U6作为内参，根据操作说明进行PI3K mRNA、MYOCD mRNA表达的检测。引物序列见表1。PCR反应体系(20 μL)：上、下游引物各0.4 μL、miR 0.5 μL，用ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：94 ℃10 s，94 ℃5 s，52 ℃30 s退火，72 ℃15 s，然后40个循环。实验重复3次，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.4 AM细胞增殖和迁移的检测转染48 h后，收集细胞，利用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，用光密度(OD)值表示。Transwell小室侵袭实验检测转染后细胞的体外侵袭力，以穿膜细胞数表示。严格按照试剂盒说明书进行操作，实验重复3次。

1.5 AM细胞PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白表达的检测采用Western blot法检测。取两组AM细胞，匀浆器充分研磨后加入裂解液裂解并提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。根据目标蛋白大小配置适合浓度的凝胶、分离胶和浓缩胶。电泳加压转膜后脱脂奶粉封闭1 h。加入PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白一抗(按照1∶1 000稀释)，以β-actin(按1∶5 000稀释)作为内参。除去一抗，洗涤后加入二抗。室温孵育2 h，漂洗、化学发光法显影，采用Image J软件分析，以目的蛋白与内参条带灰度值的比值代表目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理采用SPSS 22.0进行分析。两组AM细胞增殖和侵袭能力，PI3K和MYOCD mRNA表达水平的比较采用两独立样本t检验，PI3K/MYOCD siRNA组AM细胞PI3K、MYOCD、AKT和Bcl-2蛋白表达的相关性采用Pearson相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组AM细胞PI3K、MYOCD mRNA表达水平比较见表2。

表2 两组AM细胞PI3K和MYOCD mRNA水平比较

2.2 两组AM细胞增殖和侵袭能力比较见表3。

表3 两组AM细胞增殖和侵袭能力表达水平比较

2.3 两组AM细胞PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白表达水平比较与对照组相比，PI3K/MYOCD siRNA组AM细胞的PI3K、MYOCD、AKT蛋白水平降低，而Bcl-2蛋白水平升高，见表4。

表4 两组AM细胞PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白水平比较

2.4 PI3K/MYOCD siRNA组AM细胞的PI3K、MYOCD、AKT、Bcl-2蛋白表达的相关性PI3K/MYOCD siRNA组AM细胞的PI3K蛋白与MYOCD、AKT蛋白呈正相关，与Bcl-2蛋白呈负相关(r=0.736、0.721、-0.693，P<0.001)，而MYOCD蛋白与AKT蛋白呈正相关，与Bcl-2蛋白呈负相关(r=0.748、-0.687，P<0.001)。

3 讨论

AM是临床上较为常见的良性肿瘤之一，可发病于任何年龄段人群以及身体任何部位[9-11]。目前临床主要采取镇痛药对AM患者进行治疗，尚缺乏有效抑制AM细胞生长的药物。

PI3K是参与细胞生长、增殖、代谢、运动、存活和凋亡等正常细胞过程的关键调节因子。PI3K作为一种激酶，能够磷酸化磷脂酰肌醇环的羟基。PI3K由两个结构域组成：催化结构域P110和调控结构域P85[12]。PI3K通常是通过与激活受体结合的调节亚基直接被激活或通过适配器分子间接被激活。PI3K也可以被GTP结合的RAS蛋白激活[13]。MYOCD已被证实在部分疾病中表达会升高[14]，但目前尚未完全明确其作用机制。

PI3K/MYOCD信号通路是促进细胞生长和增殖的重要途径。过度激活这一信号通路可过度刺激细胞，导致细胞异常增殖，并最终导致肿瘤的发生发展。PI3K通路异常在肿瘤疾病中非常常见，并在肿瘤转化中起作用。PI3K是一个常见的突变激活靶点，PIK3基因有两种突变，一是基因拷贝数异常，二是点突变导致PI3K持续激活[15]。MYOCD基因的常见突变是基因拷贝数的异常丢失和失活点突变[16]。

有研究[17]发现PI3K mRNA过表达的AM细胞的增殖能力明显加强，PI3K在AM病情发展中具有正向促进作用。Zhao等[18]研究结果显示抑制MYOCD mRNA表达的AM细胞增殖能力下降。本研究结果显示，抑制PI3K/MYOCD mRNA表达的AM细胞增殖和侵袭能力明显受抑。

有研究[19]表明，PI3K常与AKT相互作用，促进各种肿瘤疾病的发生发展。AKT可降低凋亡蛋白活性，提高细胞的生存，AKT对Bcl-2家族成员、Bax蛋白和Bim蛋白的水平均具有反向调节作用，还可通过影响FOXO和p53等转录因子，降低BH3蛋白的表达[20-21]。本研究结果显示，PI3K/MYOCD siRNA组细胞AKT蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高；AKT蛋白与PI3K、MYOCD蛋白呈正相关，而Bcl-2蛋白与PI3K、MYOCD蛋白呈负相关，提示下调PI3K以及MYOCD蛋白表达可能通过正向调控AKT蛋白、负向调控Bcl-2蛋白水平，抑制AM细胞的增殖和侵袭。

综上所述，抑制PI3K/MYOCD信号通路可能通过调控AKT、Bcl-2等蛋白，抑制AM细胞的增殖和侵袭，这可成为AM临床靶向治疗的研究新思路。