替硝唑口腔贴片体外释药规律研究

张玉滢，薛 阳，岳美涵，郑书兴，孙 惠*

（1.通化师范学院医药学院，通化134002；2.长春金赛药业有限责任公司，长春130012）

替硝唑(甲硝磺酰咪唑，Tinidazole)为第二代硝基咪唑类衍生物， 在体内通过电子传递方式转化成细胞毒性形式，从而导致细胞螺旋结构丧失、模板功能受损和链断裂，最终导致细胞死亡[1]。 主要用于治疗腔道细菌性疾病如细菌性阴道病、牙周炎、滴虫病及阿米巴虫病[2-5]。替硝唑与第一代硝基咪唑类药物甲硝唑相比，消除半衰期相对延长，约为甲硝唑的两倍，使其具有更高和更持久的血药浓度[6]。替硝唑毒性极小[7]，不会产生溶血现象，对患者的血管系统影响较小，不良反应少。 替硝唑口腔贴片以局部给药的方式将药物贴于病灶处，使药物直接进入牙周袋或冠周带， 可保持局部较高的血药浓度，因而抗菌与杀菌效果显著。本文采用桨碟法进行体外释药实验， 并通过体外模型比较探究替硝唑口腔贴片体外释药规律， 为口腔贴片处方合理化及体内药代动力学研究提供依据。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

TU-1810 型紫外-可见分光光度计， 北京普析通用仪器有限责任公司；ZRS-8G 型溶出测试仪，天津市新天光分析仪器技术有限公司； 万分之一天平， 梅特勒-托利多。

1.2 材料

替硝唑标准品（B27043，HPLC≥98%），上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钾，国药集团化学试剂有限公司，批号20180314；磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司，批号2018011070；氯化钠，天津市致远化学试剂有限公司，批号2018082030。

2 实验方法

2.1 替硝唑含量测定方法学

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 对照品溶液的制备

精密称取替硝唑对照品5mg，以人工唾液为溶剂，溶解并定容至10mL 容量瓶中， 制成替硝唑对照品母液。

2.1.1.2 供试品溶液的制备

取替硝唑口腔贴片5 片， 用研钵粉碎并全部过7号筛， 精密称取一定量的制剂粉末 （相当于替硝唑5mg），置于10mL 容量瓶中，用人工唾液溶解并定容；吸取上述溶液1mL 置10mL 容量瓶中，用人工唾液定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.2 检测波长的确立

取对照品母液，用人工唾液稀释成一定浓度。以人工唾液为空白， 于200～600 nm 范围内进行紫外波长扫描。

2.1.3 线性与范围

精密吸取70、100、150、200、250、300μL 对照品母液用适量人工唾液分别稀释至10mL，制成系列对照品溶液。 以人工唾液为空白， 在检测波长处测定吸光度（A）。 以替硝唑浓度c 为横坐标，A 值为纵坐标作标准曲线，得回归方程。

2.1.4 精密度试验

取同一对照品溶液在检测波长处重复测定6 次，记录A 值，并计算其RSD 值。

2.1.5 重复性试验

取同一批次的供试品6 份，按照“供试品溶液的制备” 方法处理，在检测波长处测定，记录A 值，并计算其RSD 值。

2.1.6 稳定性试验

取供试品溶液1 份，分别于0、0.5、1、2、4、6、8h 在检定波长下测定，记录A 值，并计算其RSD 值，考察样品稳定性。

2.1.7 加样回收率试验

取同一批次的供试品9 份， 分别加入替硝唑对照品溶液高、中、低（1.2∶1，1∶1，0.8∶1）三个比例，按照“供试品溶液的制备” 方法处理，测定A 值，计算回收率及RSD 值。

2.2 体外释药规律的研究

依据《中国药典》（2020 年版）四部（通则0931）溶出度与释放度测定法进行实验，采用第四法桨碟法中方法1 进行实验[8]。 释放介质为新配的人工唾液500mL，转速为100±2r·min-1，温度37±0.5℃。 分别于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0h 时取释放液5mL（同时补充同温等量释放介质）；用紫外分光光度法测定替硝唑的吸光度值，每个时间点平行6 次。按照下列公式进行计算累积释放率， 经计算即可求出制剂各时间点的累积释放率， 并采用5 种体外释药方程零级方程 （Mt/M∞=kt），一级方程(Ln（1-Mt/M∞）=-kt），Higuchi 方程（Mt/M∞=kt1/2），Ritger-Peppas 方程（Mt/M∞=ktn），Hixson-CroweLL 方程（（1- Mt/M∞）1/3=1- kt）进行拟合。 探究体外释药规律。

3 结果

3.1 替硝唑含量测定方法学

3.1.1 检测波长的确立

在200～600nm 范围内进行紫外扫描，确定替硝唑在人工唾液中的最大紫外吸收波长为317nm， 且供试品溶液中无其他杂质峰干扰，专属性较好。

3.1.2 线性与范围

以替硝唑浓度c 为横坐标，A 值为纵坐标作标准曲线， 得到标准回归方程A= 0.0505c+0.0165，R2=0.9994。 结果表明替硝唑在3.521～15.090μg·mL-1的范围内线性关系良好， 可以应用此方程进行替硝唑含量的计算。

3.1.3 精密度试验

取同一对照品溶液在317nm 处重复测定6 次，6次测定结果的RSD 为0.26%，小于2%，符合规定。 说明仪器精密度良好， 可以应用此仪器对替硝唑进行含量测定。

3.1.4 重复性试验

取同一批次的供试品6 份，按照“供试品溶液的制备” 方法处理，测定A 值。 吸光度值RSD 为0.80%，小于2%。 表明本方法重现性良好，方法可行。

3.1.5 稳定性试验

测定供试品溶液0、0.5、1、2、4、6、8h 的吸光度值，吸光度RSD 为1.07%，小于2%，表明替硝唑在样品处理后的8h 内稳定，满足实验过程需要。

3.1.6 加样回收率实验

取同一批次的供试品9 份， 分别加入替硝唑对照品溶液高、中、低（1.2∶1，1∶1，0.8∶1）三个比例，测定吸光度值，计算回收率及RSD 值。 结果见表1。

表1 加样回收实验数据表

平均回收率为98.58%，RSD 值为0.84%， 结果均符合加样回收率的要求，此处理方法合理可行。

3.2 体外释药规律研究

依据《中国药典》（2020 年版）四部（通则0931）溶出度与释放度测定法进行体外溶出度测试， 用紫外分光光度法测定替硝唑的吸光度值， 经计算求出制剂各时间点的累积释放率，结果见表2，图1。

表2 替硝唑口腔贴片体外溶出累积度结果（n=6，n±s）

图1 替硝唑口腔贴片累积释放曲线

通过模拟口腔内环境进行替硝唑口腔贴片体外释药规律研究，实验结果表明，替硝唑口腔贴片在前4h内药物释放速率较快， 在3h 累积释放率达到80%左右，4h 累积释放率达到95%左右，药物可以在4～6h 之内充分释放，避免影响正常进食。

采用5 种体外释药方程零级方程 （Mt/M∞=kt），一级方程(Ln（1-Mt/M∞）=-kt），Higuchi 方程（Mt/M∞=kt1/2），Ritger-Peppas 方程（Mt/M∞=ktn），Hixson-CroweLL 方程（（1- Mt/M∞）1/3=1- kt） 进行拟合。 拟合方程结果见表3和图2-6。

表3 替硝唑口腔贴片拟合方程结果

图2 零级方程

图3 一级方程

图4 Higuchi 方程

图5 Ritger-Peppas 方程

图6 Hixson-CroweLL 方程

通过对拟合优度（R2）进行曲线拟合分析，零级方程、 一级方程拟合效果较差，Hixson-CroweLL 方程和Ritger-Peppas 方程较好， 但Ritger-Peppas 方程的R2最大为0.9917， 因此替硝唑口腔贴片的体外释药规律符合Ritger-Peppas 方程。 方程中n 是表征释放机制的特征参数，依据n 的大小判断拟合机理。对于圆柱形片剂而言，当n＜0.45 时，为Fick 扩散；当0.45＜n＜0.89 时，为非Fick 扩散，药物扩散和骨架溶蚀协同作用；当n＞0.89 时，为骨架溶蚀机制[9]。 替硝唑口腔贴片符合Ritger-Peppas 方程，y = 0.5953x - 0.8954，（n=0.5953），为非Fick 扩散，并且药物在释药时是通过扩散和骨架溶蚀协同作用。前期药物释放以扩散为主，是由于生物粘附剂水化溶胀所导致， 后期凝胶层不断溶胀导致出现溶蚀，药物的释放以凝胶骨架溶蚀作用为主。

4 讨论

本研究建立以紫外分光光度法测定替硝唑含量，通对方法学内容的考察，实验结果均符合规定。此实验方法简单快捷， 可以应用此方法测定替硝唑含量并计算其体外释放度， 为探究制剂的体外释放提供数据支持。

替硝唑口腔贴片直接粘贴到口腔病灶部位， 制剂较小并有一定黏度， 故采用桨碟法进行口腔贴片体外释药研究。 桨碟法可以将贴片粘贴于网碟上防止药物在实验中随释放液流动，避免增大实验误差，保障实验结果的准确性。

为更加接近体内药物释放规律，以磷酸二氢钾-磷酸氢二钠制成缓冲溶液， 配合氯化钠制成人工口腔唾液为释放介质。人工口腔唾液制备简单，更接近口腔内环境，增大体内外释药之间的相关性。

本研究通过对替硝唑口腔贴片体外释放规律研究，该制剂在体外4h 释放达95%，不影响正常进食，药物顺应性良好。通过对该制剂的体外释药规律探究，一方面验证药物制剂的处方合理性， 另一方面对替硝唑口腔贴片的质量标准的制定和药效学研究提供依据。