非班太尔对照品的定值研究

马秋冉，张 璐，董玲玲，范 强，张秀英

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

非班太尔(Febantel)，又名苯硫胍，其化学名称为[[2-(甲氧乙酰氨基)-4-(苯硫基)苯基]亚氨羰基]二氨基甲酸二甲酯，最先由德国拜耳制药公司研制成功[1]，主要用于治疗和控制动物的胃肠蛔虫、绦虫等蠕虫[2-3]。非班太尔没有单独使用的剂型，通常将其与吡喹酮和噻嘧啶联合使用制成复方非班太尔片，作为宠物驱虫药[4]。经国家兽药基础信息查询系统显示，已有3个厂家获批该制剂的新药证书并生产销售。在生产过程中，需使用非班太尔、吡喹酮和噻嘧啶对照品作为标尺，衡量产品质量。目前，国内已供应吡喹酮和噻嘧啶对照品，而非班太尔对照品只能依赖进口，其价格昂贵、购买周期长和供应不及时等问题，给国内企业的研发与生产带来不便。因此，为了更好地对该品种进行质量控制，降低企业研发生产成本，研制首批非班太尔对照品。本文根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[5]和《中华人民共和国兽药典》2015年版[6]的要求，分别采用质量平衡法和差示扫描量热法(DSC法)2种方法对非班太尔对照品的含量进行定值研究。其中，质量平衡法[7]也称为杂质扣除法，是通过测量其中所有杂质的含量，从100%中减去杂质的质量分数，获得主成分的质量分数即含量的方法。本文以高效液相色谱法作为有机杂质检查方法，以卡尔费休氏滴定法作为水分检查方法，以气相色谱法作为可挥发性溶剂检查法，以炽灼残渣检查法作为不可挥发性杂质检查法。DSC法基于热动力学原理，通过度量非班太尔对照品中的总杂质绝对含量来对其进行定值，该方法适用于加热过程中不发生热分解、不与外界产生热效应的有机纯物质的定值测定[8]。2种方法的测定能够更好地保证非班太尔对照品赋值的准确性。

1 仪器与试药

仪器、试验材料与试剂：Waters e2695 高效液相色谱仪(Empower 2 色谱工作站)，Waters 2998 二极管阵列检测器(PDA)，Waters 2489 紫外检测器(UV)，Mettler XS205 电子分析天平(精度0.01 mg)，Agilent 7698A 气相色谱仪，Agilent 7697A顶空进样器，瑞士万通701KF水分测定仪，美国TA Q200 DSC仪，CWF11/5 马弗炉。

非班太尔精制原料由陕西汉江药业集团股份有限公司提供(批号为1533015)，非班太尔系统适用性对照品由EP提供(批号为1.1)，甲醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯。

2 方法与结果

2.1 非班太尔对照品制备 采用红外分光光度法、紫外-可见分光光度法、元素分析法、X射线衍射法、核磁共振法、质谱法对非班太尔精制原料进行结构确认，测定结果与目标结构一致。将非班太尔精制原料分装成500份(每份约100 mg)，遮光密闭，在2～8 ℃ 保存。非班太尔结构如图1所示。

图1 非班太尔结构图Fig 1 Strucure of febantel

2.2 质量平衡法定量

2.2.1 纯度分析

2.2.1.1 色谱条件与系统适用性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾(取磷酸二氢钾6.8 g，置1000 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度)-乙腈(60∶40)为流动相；检测波长为280 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL。杂质A、杂质B和杂质C的分离度应符合要求。

2.2.1.2 溶剂空白制备 混合溶液(乙腈∶四氢呋喃=1∶1)。

2.2.1.3 供试品溶液制备 取非班太尔对照品样品10 mg，置10 mL量瓶中，用混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.1.4 系统适用性溶液制备 取非班太尔系统适用性对照品(含杂质A、杂质B和杂质C)5 mg溶于1 mL混合溶液，摇匀，即得。

2.2.1.5 测定结果 按2.2.1.3项下配制方法，平衡制备6份供试品溶液。精密量取溶剂空白、系统适用性溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。其中溶剂空白(图2)对非班太尔测定无干扰；系统适用性色谱图(图3)中，杂质A、B、C和非班太尔峰与相邻色谱峰的分离度均符合要求；从供试品溶液色谱图(图4)可知，非班太尔对照品样品中有关物质包括杂质A、杂质B和2个未知杂质。按自身对照法以峰面积计算，非班太尔对照品样品纯度分别为：99.880%、99.907%、99.900%、99.903%、99.898%、99.901%，均值(n=6)为99.898%，标准偏差为0.009%。

图2 溶剂空白色谱图Fig 2 Liquid chromatogram of blank solution

图3 系统适用性溶液色谱图Fig 3 Liquid chromatogram of system suitability solution

图4 供试品溶液色谱图Fig 4 Liquid chromatogram of test solution

2.2.2 水分 参照《中华人民共和国兽药典》2015年版一部附录限量检查法(水分测定法)，采用卡尔费休氏滴定法测定。实验前，精密称取标准水约20 mg，注入水分测定仪，标定滴定液，平行标定3次，3次连续标定结果的相对偏差小于1%。精密称取非班太尔对照品样品100 mg，迅速打开滴定池上玻璃塞将其置于反应瓶中，仪器触控面板处输入样品称样量，滴定结束后系统自动显示计算含水量。平行测定6份，结果为0.068%、0.063%、0.067%、0.081%、0.084%、0.074%，均值(n=6)为0.073%，标准偏差为0.008%。

2.2.3 炽灼残渣 参照《中华人民共和国兽药典》2015年版一部附录限量检查法(炽灼残渣检查法)试验。平行测定6份，结果为：0.064%、0.056%、0.050%、0.045%、0.059%、0.054%，均值(n=6)为0.055%，标准偏差为0.007%。

2.2.4 残留溶剂 参照《中华人民共和国兽药典》2015年版一部附录限量检查法(残留溶剂测定法)，采用顶空进样方式。根据非班太尔精制原料合成路线可知，残留溶剂为甲醇。

2.2.4.1 气相色谱条件 以氰丙基苯基聚硅氧烷为固定液(DB624 Agilent毛细管色谱柱320 μm×1.8 μm，30 m)；起始温度为50 ℃，保持5 min，然后以每分钟15 ℃的速率升温至180 ℃，保持3 min；进样口温度为200 ℃；氢火焰离子化检测器(FID)温度为230 ℃；氮气为载气，流速为1 mL/min，分流比20∶1；顶空进样器平衡温度80 ℃，平衡时间30分钟，传输线温度为120 ℃。

2.2.4.2 空白溶剂制备 取N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1 mL置20 mL顶空瓶中，立即用压盖器密封。

2.2.4.3 对照品溶液制备 取甲醇约30 mg置100 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL置20 mL顶空瓶中，立即用压盖器密封。

2.2.4.4 供试品溶液制备 取非班太尔对照品样品约100 mg，精密称定，置20 mL顶空瓶中，加1 mL DMF溶剂溶解，立即用压盖器密封。

2.2.4.5 按2.2.4.4项下配制方法，平衡制备6份供试品溶液。按2.2.4.1项下色谱条件进行测定。结果为0.106%、0.106%、0.101%、0.100%、0.106%、0.104%，均值(n=6)为0.104%，标准偏差为0.003%。

2.2.5 质量平衡法计算 选用格拉布斯(Grubbs)准则，对上述试验数据是否存在可疑值进行判别，结果显示无可疑值。以含量=纯度×(1-水分含量-炽灼残渣含量-残留溶剂含量)×100%为公式，计算非班太尔对照品样品含量(表1)。

表1 质量平衡法定值结果Tab 1 The result of mass balance method(%)

2.3 差示扫描量热法定值

2.3.1 测定条件 测量采用动态法，连续加热使样品熔融，获得数据。升温速率：1 ℃/min；升温区间：110～140 ℃；炉内气体：氮气。

2.3.2 样品制备 平行称取6份，分别置40 μL的标准AL2O3坩埚中，压盖。

2.3.3 测定结果 6份样品的测定结果为99.61%、99.71%、99.63%、99.60%、99.65%、99.63%，均值(n=6)为99.64%，标准偏差为0.039%。差示扫描量热曲线见图5。

2.4 两种方法含量定值结果等精度检验 采用科克伦法对两种方法定值结果进行等精度判定。科克伦计算公式：

Si为每种方法单次测量的标准偏差；Smax为Si中最大值。判断准则：当C≤C(α,m,n)时，表明组数据平均值间为等精度，反之判为不等精度。其中m为实验测量组数，n为每组实验检测次数，α取0.05。C=0.0182/(0.0182+0.0392)=0.18，查科克伦检验临界值表，得C(0.05,2,6)=0.8534。说明两种方法互为等精度，因此取算术平均值作为最终定值结果，即非班太尔含量定值结果为99.7%。

2.5 均匀性检验 根据JJF 1006-1994《一级标准物质技术规范》和JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的技术要求，本研究从已分装的500瓶非班太尔对照品中随机抽取15个包装单元进行均匀性检验，对随机抽取的样品从1到15编号，每个单元取3个子样，按2.2.1项下方法进行均匀性检验，测量的数据采用单因素方法分析进行统计检验，非班太尔均匀性检验结果如表2所示。F

表2 均匀性检验结果Tab 2 The result of homogeneity test

2.6 稳定性考察 为考察非班太尔对照品在长期储存条件下以及外部环境变化条件影响下，特性量值保持不变的能力，本研究按照《标准物质定值的通用原则与统计学原理》的有关要求，按2.2.1项下方法开展了长期和短期的稳定性考察。长期稳定性考察分别在第0、1、3、6、9、12个月进行考察；短期稳定性考察，则将样品分别置于高温(60 ℃)、高湿(90% ± 5%，25 ℃)、光照(照度4500 Lx±500 Lx)条件下，分别于2、4、6、8、10 d进行考察。采用趋势分析对稳定性监测结果进行考察，若|b1|

表3 长期稳定性与短期稳定性统计Tab 3 The statistics of long-term and short-term stability test

2.7 不确定度评估 根据非班太尔对照品研制过程，详细分析了每个环节引入的不确定度。不确定度主要由3部分组成，即均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度(短期稳定性和长期稳定性)以及定值过程中引入的不确定度。

2.7.1 质量平衡法定值不确定度

2.7.3 均匀性与稳定性的不确定度 根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中均匀性与稳定性不确定评估的计算公式，计算均匀性不确定度(uss)为0.0033%，稳定性不确定(us)为0.0072%。

3 小结与讨论

本文采用质量平衡法和差示扫描量热法联合对非班太尔对照品进行定值，两种方法测定含量的结果基本一致。经上述两种定值方法的测定，非班太尔对照品最终定值结果为99.7% ± 0.3%，k=2，P=0.95。

其中，质量平衡法是一种具有较高准确度的方法，其能够直接溯源到SI中质量单位(kg)，世界卫生组织及欧洲药典均推荐使用该方法作为药物标准物质的定值方法[9]。但该方法也具有一定的局限性，如不同杂质响应值的差异及色谱分离能力的限制，这些因素都将导致质量平衡法测定结果与实际值偏离。本文采用《欧洲药典》非班太尔有关物质检查方法的色谱条件作为纯度分析方法，该方法能够检出非班太尔对照品的全部有机杂质，保证了纯度分析的准确性。DSC法是一种热分析方法，能够在程序控制温度下，测量输入到试样与参比物的功率差与温度之间的关系，主要用于材料的研发、性能检测与质量控制。近年来，科研工作者将该方法拓展用于化学药品对照品的纯度分析。刘毅[10]等采用该方法测定安替比林、异丙安替比林等化学药品对照品纯度。王路[11]等利用DSC法对熊果苷对照品进行定值研究，并制备出首批熊果苷对照品应用于化妆品行业的质量控制。DSC方法的测定结果受称样量、升温速率、气体种类影响较大。应根据样品热效应大小调节样品量，通常为1～3 mg之间；DSC用于纯度分析时升温速率应在0.5～1 ℃/min，较快的升温速率虽能提高灵敏度，但分辨率会显著下降，造成测定结果偏差；使用惰性气体可避免产生氧化反应峰，同时又可减少试样挥发对监测器的腐蚀[12]。

本文首次对非班太尔对照品进行定值研究，其结果符合国家兽用对照品的相关要求，并已经过兽药标准物质化学药品专业委员会审批，可作为国家兽用标准品发放和使用。此次定值研究不仅填补了国内非班太尔在定值研究方面的空白，而且为我国兽药行业的发展，特别是宠物用药的发展提供了支持，具有重大意义。