松果菊苷对严重烧伤大鼠急性肾损伤的保护作用及其机制

李 露,刘晓茜,王清艳,魏 茹

(西安医学院第一附属医院肾内科,西安 710077;*通讯作者,E-mail:liluxayxy@163.com)

重度烧伤可导致多种全身性的并发症,包括全身炎症反应综合征、脓毒症和多器官功能障碍综合征等[1]。肾脏是烧伤后极易受累的靶器官之一,急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)也是重度烧伤后常见且严重的并发症[2]。烧伤后早期AKI的发生与患者的预后紧密相关,发生早期AKI的重度烧伤患者往往预后较差且死亡率较高[3]。因此,对于烧伤后早期AKI的预防和干预是改善重度烧伤患者预后、降低死亡率的关键。近年来,关于严重烧伤致AKI的病理生理机制仍未完全阐明,越来越多的证据表明炎症反应、氧化应激和凋亡在其发生发展中起着关键作用[4,5]。

松果菊苷(echinacoside, ECH)是从管花肉苁蓉植物中提取的一种天然苯乙醇苷类化合物,已被报道具有多种生物活性,如抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用[6]。近年来研究发现,ECH具有显著的肾脏保护作用[7-9],我们课题组前期研究也观察到ECH可以明显减轻脓毒症小鼠急性肾损伤[10]。然而,ECH能否保护肾脏免受严重烧伤所致的AKI及其具体机制尚不清楚。因此,本研究通过背部烫伤法构建重度烧伤模型,探讨ECH对严重烧伤后AKI的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验动物

清洁级雄性SD大鼠60只,8周龄,由西安医学院动物实验中心提供。松果菊苷(echinacoside, ECH)购自美国Sigma公司。SIRT3通路抑制剂3-TYP购自美国GlpBio公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),丙二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)检测试剂盒购自美国Roche公司。SIRT3、gp91phox、cleaved Caspase-3和β-actin抗体购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立及分组处理 将60只雄性SD大鼠随机均分为4组:假烧伤组(sham)、烧伤组(burn)、烧伤+松果菊苷处理组(burn+ECH)和烧伤+松果菊苷处理+抑制剂组(burn+ECH+3-TYP)。烧伤大鼠模型建立如下[11]:SD大鼠经戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后,背部脱毛仰卧位固定于中空的特制烧伤装置上,仅将大鼠背部沉浸到100 ℃的热水中15 s,以造成30%体表面积全层皮肤Ⅲ度烧伤模型。术后各组大鼠腹腔注射5 ml/kg的乳酸林格液复苏补液治疗,同时术后即刻给予大鼠皮下注射0.25 mg/kg丁丙诺啡镇痛,且每隔12 h给予一次维持镇痛治疗。假烧伤组大鼠经麻醉后将其沉浸到25 ℃的温水中15 s,余步骤与烧伤组相同。burn+ECH组和burn+ECH+3-TYP组大鼠在烧伤后0 h和6 h给予腹腔注射ECH(100 mg/kg)药物处理2次,且burn+ECH+3-TYP组大鼠在给药处理的同时给予3-TYP(50 mg/kg)腹腔注射。各组大鼠于处理完成后48 h经戊巴比妥钠过量麻醉后取材。

1.2.2 肾功能测定 采集大鼠血样,以3 000 r/min离心10 min获得血清样本,用酶标仪测定血清中尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和血肌酐(serum creatinine, Cr)的水平。

1.2.3 HE染色观察肾组织损伤情况 大鼠肾标本经福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋后切成3 μm厚的切片。切片在脱蜡后用HE染色。如文献[12]所述,对肾组织学改变进行评分。每片随机选取5个高倍视野进行盲法观察。

1.2.4 实时定量PCR(RT-PCR)检测炎症因子表达水平 测定炎症因子白细胞介素1-β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达以评价肾脏组织的炎症反应状态。用TRIzol试剂从组织中分离总RNA,逆转录实验生成cDNA。用BIO-RAD分光光度法测定RNA和cDNA的浓度和纯度。引物采用Primer Premier 6.0软件设计,由上海吉凯基因有限公司合成。在iQTM5 RT-PCR系统中进行PCR扩增,采用2-ΔΔCt法对靶基因表达量进行相对定量。引物序列信息见表1。

表1 相关炎症因子引物序列

1.2.5 免疫荧光染色检测肾组织NF-κB表达情况 将前述制备好的石蜡切片脱蜡后,在NF-κB抗体中4 ℃孵育24 h,PBS洗涤切片后用DAPI染细胞核,随机取5个高倍视野观察进行盲法观察,用Image Pro图像分析软件分析免疫荧光染色图。

1.2.6 试剂盒测定肾组织MDA、SOD和GSH-Px水平 测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),以评价肾脏组织的氧化应激状态。各组肾组织匀浆按照相应检测试剂盒说明书反应后,用酶标仪测量吸光度值以计算组织MDA、SOD和GSH水平。

1.2.7 TUNEL染色检测肾组织细胞凋亡情况 将前述制备好的石蜡切片按照TUNEL检测试剂盒染色后在显微镜下观察和拍照,每张切片随机选取5个高倍视野进行盲法观察。DAPI染色的每一个阳性点均作为一个细胞计数,与之重叠的绿点计数为凋亡细胞,用盲法测定凋亡细胞与总细胞数的比值来确定凋亡指数,进而反应肾组织细胞凋亡程度。

1.2.8 Western blot检测SIRT3、gp91phox、cleaved Caspase-3蛋白表达水平 取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在37 ℃下封闭膜2 h,用特异性SIRT3(1 ∶1 000)、gp91phox(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)一抗孵育24 h。然后用相应的酶标山羊抗兔(1 ∶4 000)二抗在37 ℃下孵育膜1 h。用ECL发光液并通过Bio-Rad系统成像,观察膜上的蛋白条带。以β-actin作为内参,Image Lab软件分析结果。

1.3 统计学分析

所有数据均以平均值±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。数据采用SPSS 13.0程序进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能比较及肾组织形态学改变

检测大鼠肾功能指标显示,与sham组相比,burn组大鼠血清中BUN和Cr含量明显上升(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠血清中BUN和Cr含量均显著降低(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠血清中BUN和Cr含量又明显上升(P<0.05,见图1)。大鼠肾组织HE染色结果显示,sham组大鼠肾组织形态清晰、正常,无病理损伤;burn组大鼠肾脏可见肾小球体积增大,肾小管肿胀、坏死伴空泡样变性,并伴有大量炎性细胞浸润,肾组织损伤评分明显升高;burn+ECH组大鼠肾组织病理损伤明显减轻,肾组织损伤评分显著降低;而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织病理损伤明显加重,肾组织损伤评分又显著升高(见图1)。

图1 各组大鼠的肾组织结构及肾功能比较 (×400)Figure 1 Comparison of renal tissue structure and renal function between groups (×400)

2.2 各组大鼠肾组织炎症反应水平比较

RT-PCR结果显示,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量显著增加(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量明显降低(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量又明显上升(P<0.05,见图2)。免疫荧光染色显示,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中NF-κB表达量显著增加(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织中NF-κB表达量明显降低(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织中NF-κB的表达又明显增强(P<0.05,见图3)。

与sham组相比,*P<0.05,**P<0.01;与burn组相比,##P<0.01;与burn+ECH组相比,&&P<0.01图2 各组大鼠肾组织炎症因子表达水平比较Figure 2 Comparison of expression of inflammatory response factors in renal tissue between groups

图3 各组大鼠肾组织NF-κB表达水平比较 (×400)Figure 3 Comparison of expression of NF-κB in renal tissue between groups (×400)

2.3 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较

检测大鼠肾组织氧化应激水平显示,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量显著减低,膜脂过氧化产物MDA含量显著增加(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织中SOD和GSH-Px的含量显著升高,MDA含量显著减少(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织中SOD和GSH-Px的含量又显著下降,MDA含量又显著上升(P<0.05,见图4)。Western blot显示,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中gp91phox生成量显著增加(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织中gp91phox的生成明显被抑制(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织中gp91phox的生成又明显增多(P<0.05,见图4)。

2.4 各组大鼠肾组织凋亡水平及SIRT3信号表达比较

Western blot显示,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中SIRT3蛋白表达及SIRT3去乙酰化活性显著减低(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织中SIRT3蛋白表达及SIRT3去乙酰化活性显著升高(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织中SIRT3蛋白表达及SIRT3去乙酰化活性又显著被抑制(P<0.05,见图5)。TUNEL染色检测凋亡结果显示,与sham组相比,burn组大鼠肾组织凋亡细胞明显增加,凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05);与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织细胞凋亡明显被抑制,cleaved Caspase-3蛋白表达显著下降(P<0.05);而与burn+ECH组比较,burn+ECH+3-TYP组大鼠肾组织细胞凋亡又明显增多,cleaved Caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.05,见图5,6)。

与sham组相比,*P<0.05,**P<0.01;与burn组相比,##P<0.01;与burn+ECH组相比,&&P<0.01图4 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较Figure 4 Comparison of renal oxidative stress level between groups

与sham组相比,*P<0.05,**P<0.01;与burn组相比,##P<0.01;与burn+ECH组相比,&&P<0.01图5 各组大鼠肾组织SIRT3信号及凋亡蛋白表达比较Figure 5 Comparison of expression of SIRT3 signaling and apoptosis protein in renal tissue between groups

图6 各组大鼠肾组织凋亡水平比较 (×400)Figure 6 Comparison of apoptosis level in renal tissue between groups (×400)

3 讨论

急性肾损伤是临床常见的一组综合征,常继发于各种严重创伤、感染、外科术后应激和肾毒性药物等高危因素[13]。烧伤作为一种严重创伤,除导致皮肤和/或皮下组织直接的热力学损伤之外,还可诱发重要脏器的继发性损害[1]。急性肾损伤已成为大面积深度烧伤患者的主要并发症,并且早期急性肾损伤的出现往往预示着重度烧伤患者的不良预后甚至死亡[3,14]。尽管与严重烧伤相关的急性肾损伤发病机制取得了一定的研究进展[4,5],但对该疾病人群的治疗却没有相应程度的进步。因此,寻找可能的早期干预方式对于改善重度烧伤后急性肾损伤患者的治疗效果、减少社会经济负担具有重要意义。

近年来,关于烧伤后急性肾损伤发生发展的生物学机制多集中于炎症反应、氧化应激损伤与组织细胞凋亡等方面[4,5,15]。一方面,重度烧伤患者的损伤坏死物质入血合并创伤应激可导致机体全身炎症反应,烧伤早期即存在各种炎症细胞动员,其伴随着大量炎症介质的释放可通过血液循环可到达各远位脏器(如肾脏),进而引起血管通透性的增加以及肾组织的直接损伤[12,16]。另一方面,烧伤患者常伴有机体氧化应激水平的升高、循环及局部组织中的活性氧释放增加,导致肾脏组织细胞膜脂质过氧化和内源性抗氧化酶耗损,并最终引起细胞内蛋白氧化和DNA损伤[17,18]。而细胞凋亡是肾组织在面对烧伤、缺血、辐射、创伤和毒物等损伤时的常见反应,循环系统中促凋亡介质的释放参与了患者肾功能改变并影响预后[19,20]。在本研究中,我们同样发现,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量明显升高,NF-κB表达量明显增加;同时burn组大鼠肾组织中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量显著降低,脂质过氧化物MDA含量明显上升,氧化应激相关蛋白gp91phox的生成明显增多;此外,burn组大鼠肾组织细胞凋亡明显,凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达显著上调。以上结果进一步明确了炎症反应、氧化应激损伤和细胞调亡是烧伤后急性肾损伤重要损伤机制,而针对上述损伤机制的早期干预可能是处理烧伤后急性肾损伤的有效途径之一。

研究发现松果菊苷具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等广泛的药理作用,对多个系统的疾病展现了良好的治疗效果[21]。值得注意的是,松果菊苷近年来被证实具有显著的肾脏保护作用,牛世煜等[22]报道松果菊苷可能通过抑制氧化应激及炎症反应发生,进而减轻糖尿病肾损伤。姜瑞凤等[23]报道松果菊苷对四氯化碳诱导大鼠急性肾损伤起保护作用,相关机制可能与松果菊苷抑制细胞凋亡和炎症产生有关。此外,我们课题组前期研究也观察到松果菊苷可以明显减轻脓毒症小鼠急性肾损伤[10]。在本研究中,我们首先发现,与burn组相比,burn+ECH组大鼠血清中两项急性肾损伤诊断的敏感生物学标记BUN和Cr的含量均显著降低,并且burn+ECH组大鼠肾组织病理损伤明显减轻,肾组织损伤评分显著降低,以上结果提示,松果菊苷对于烧伤后急性肾损伤具有潜在的缓解作用。进一步探讨其作用机制发现,与burn组相比,burn+ECH组大鼠肾组织中炎症因子含量明显降低,炎症反应明显减弱;同时burn+ECH组大鼠肾组织中抗氧化物的含量显著升高,脂质过氧化物含量明显减少,氧化应激损伤明显被抑制;此外,burn+ECH组大鼠肾组织细胞凋亡明显减少,凋亡率显著下降。以上结果提示,松果菊苷可通过抑制炎症反应、氧化应激损伤与细胞凋亡发挥抵抗严重烧伤所致的急性肾损伤作用。

沉默信息调控因子3(silent information regulator 3, SIRT3)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶,主要定位于线粒体[24]。肾脏组织的管状细胞中富含线粒体,肾小管内线粒体的改变是肾脏疾病发生发展的重要标志[25],而SIRT3作为线粒体酶参与线粒体的多种生物调节,近年来被大量文献证实其与急性肾损伤及急性肾损伤后修复密切相关[26]。既往研究表明,以SIRT3分子为靶点,上调SIRT3的表达在脓毒症、缺血再灌注、抗癌药物及造影剂等原因导致的急性肾损伤中均表现出了积极的保护效应[27-30]。特别值得注意的是,我们课题组前期研究也发现,松果菊苷可明显缓解脓毒症导致的急性肾损伤,其机制可能与激活SIRT3信号有关[10]。然而SIRT3能否介导松果菊苷减轻严重烧伤后急性肾损伤仍有待于进一步探究。本研究结果进一步证实,与sham组相比,burn组大鼠肾组织中SIRT3蛋白表达及去乙酰化活性均显著减低,给予松果菊苷处理后,burn+ECH组大鼠肾组织中SIRT3蛋白及去乙酰化活性表达均显著升高,而给予SIRT3特异性抑制剂3-TYP不仅可以逆转松果菊苷对SIRT3信号的激活作用,也显著抵消了松果菊苷在严重烧伤所致的急性肾损伤中的抗炎、抗氧化应激损伤与抗凋亡作用。以上结果提示,激活SIRT3信号通路是松果菊苷减轻严重烧伤后急性肾损伤的潜在分子机制之一。

综上所述,松果菊苷通过抑制氧化应激损伤和炎症反应减轻严重烧伤大鼠急性肾损伤,其分子机制与激活SIRT3信号通路相关。我们的研究为临床上应用松果菊苷保护严重烧伤患者的肾脏功能提供了新的理论依据。