JAK/STAT信号通路相关蛋白在脂质肾损害大鼠肾脏组织中的表达及意义

李莎莎,李 露,吴 璞,郝亚宁

(1西安医学院第一附属医院肾内科,西安 710077;2西安市第九医院肾内科;3西安交通大学第一附属医院肾内科;*通讯作者,E-mail:haoynhaoyn@163.com)

1982年,Moorhead等[1]提出“脂质肾毒性假说”,促进了肾脏病领域脂质代谢的研究。肾脏是继心、脑血管之后遭到血脂异常危害的另一个靶器官。越来越多的研究证明,肾脏脂质过多沉积可能通过氧化应激、内质网应激、炎症应激等多种机制导致慢性肾脏疾病[2,3]。JAK/STAT信号途径(Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathway)是机体内普遍存在的一条细胞因子信号转导途径,通过细胞因子参与机体内免疫细胞分化、调节免疫应答、介导炎性反应等过程[4,5]。目前相关的研究发现参与此通路的细胞因子众多,本课题组拟通过检验出异常表达的细胞因子包括STAT3、OSM等近一步阐述JAK/STAT信号通路及相关细胞因子在脂质肾损害发病机制中的作用。

1 材料及方法

1.1 动物分组

30只SD大鼠(西安交通大学医学院动物中心提供),体质量120-140 g,适应性喂养1周后,按照随机数字表法随机分为:对照组(n=15)和高脂组(n=15),其中对照组给予普通饲料喂养,高脂组大鼠给予含2%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、5%蛋黄粉的高脂饲料喂养。两组均自由饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 观察指标的变化 12周时将所有大鼠分别置于代谢笼中,收集24 h尿液,检测24 h尿蛋白定量。处死大鼠后腹主动脉取血5-6 ml,分离血清,检测血甘油三酯、总胆固醇、肌酐指标。

（3）加大对创新的支持力度，特别加大对初创、高速发展的创新型公司的支持，增加对有规模化发展潜力的创新想法的投入。

1.2.2 大鼠血清OSM浓度检测 ELISA试剂盒(96T)购自美国RDBiosciences公司。按照该试剂盒使用说明书对原倍标准品进行倍比稀释,取相应大鼠血清标本40 μl,加抗OSM抗体10 μl、链霉亲和素-HRP 50 μl,并设复孔。室温孵育30 min,洗涤液洗涤30 s×5次,每个孔依次加显色液A 50 μl和显色液B 50 μl,震荡混匀10 s,37 ℃暗处反应10 min。最后每孔加入终止液50 μl,终止反应。于450 nm波长依次测定各吸光度(OD值)。用CurveExpert1.3软件绘制出标准曲线,根据待测样品的OD值可在标准曲线上计算出相应的OSM的含量。

JAK2、STAT3在两组间表达无明显变化,差异无统计学意义(见图3)。与正常组比较,高脂组大鼠肾脏组织p-JAK2、p-STAT3表达增加(P<0.05,见图3)。

与对照组比较,高脂组OSM主要表达于皮质肾小管上皮细胞胞膜和胞质、部分间质炎性细胞胞质及胞膜,肾小球内几乎无表达(见图2);高脂组OSMR表达明显增加,主要位于皮质肾小管上皮细胞胞质及胞膜、肾间质,肾小球内皮细胞胞质少量表达,其余肾脏固有细胞几乎无表达(见图2)。

ELISA方法检测两组大鼠血清OSM的浓度，对照组OSM浓度为(22.64±4.52)ng/ml，高脂组OSM浓度为(27.57±7.17)ng/ml；与对照组比较，高脂组血清OSM水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

1.3 统计学方法

光镜下HE染色,高脂组大鼠肾小球系膜细胞增多,系膜区增宽,肾小管上皮细胞浊肿,间质可见炎性细胞浸润;PAS染色可见肾小球系膜基质明显增多(见图1)。

2.3.2 稳定性试验 取同一供试品溶液（S6），按“2.2”项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，以12号色谱峰（黄芩苷）为参照峰，计算色谱图中各共有峰相对保留时间的RSD小于0.47%，各共有峰相对峰面积的RSD小于1.49%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2 结果

2.1 大鼠血清甘油三脂、总胆固醇、24 h尿蛋白定量及血肌酐指标变化

高脂饮食造模12周时,高脂组大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和24 h尿蛋白定量较对照组明显升高(P<0.05),而血肌酐水平两组间差异无统计学意义(见表1)。

表1 12周时两组大鼠观察指标变化

2.2 肾脏病理改变

图1 两组大鼠肾脏组织病理改变 (×400)Figure 1 Pathological changes of renal tissue in the two groups (×400)

2.3 血清OSM表达情况

1.2.5 Western blot法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达 取新鲜冻存肾脏组织0.05 g加入蛋白裂解液0.5 ml,用匀浆器在冰上将肾脏组织匀浆并在冰上裂解20 min后于4 ℃ 15 000 r/min离心15 min收集上清液,考马斯蓝法测蛋白定量。取50 μg上清液蛋白上样,10%SDS-聚丙烯胺凝胶电泳分离,将凝胶内蛋白质转移到硝酸纤维膜上,5%脱脂奶粉室温摇床上封闭1 h,根据JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白分子量大小裁膜,并分别加入兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3(1 ∶250),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜液洗涤5 min×6次,再分别加入羊抗兔IgG二抗,按1 ∶15 000稀释，室温孵育1 h，TBST洗膜液洗涤5 min×6次，免疫荧光分析仪检测蛋白表达，以Odyssey图像处理系统分析蛋白表达灰度值，实验结果用目的条带灰度值与内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来表示。

坚持早中晚三巡塘制度，尤其是台风、暴雨、连续阴雨等极端天气，更应全天候坚持巡塘，观察鱼池水质变化及鱼的活动情况，发现问题及时采取处置措施。通常采用的鱼病防治方法有泼洒法、悬挂法和内服法。坚持定期泼洒药物，按时挂篓挂袋，间隔投喂药饵，防治结合，严格管控，坚决杜绝病害发生。一般每间隔15～20d，全池泼洒氯制剂一次，鱼病高发时期每间隔15d用出血宁、五黄粉等药物拌饵或制成药饵投喂，用量一般为投饵量的0.5%左右。同时打扫好池塘卫生，及时清除残饵及池中杂物，渔具使用后应放在阳光下曝晒，并药浴消毒，保持池塘环境卫生，消除治病因子。

2.4 免疫组化法检测OSM及OSMR蛋白表达情况

1.2.4 免疫组化检测OSM及OSMR在肾脏组织中的表达 兔抗大鼠OSM多克隆抗体、兔抗大鼠OSMR多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,均采用SP法,石蜡切片60 ℃烤箱2 h以上,常规脱蜡至水化,3%H202甲醇溶液消除内源性过氧化物酶,石蜡切片置pH6.6的柠檬酸缓冲液中,放于抗原修复仪5 min后自然冷却。蒸馏水洗3次,正常山羊血清室温封闭30 min后分别依次加入1 ∶100的兔抗大鼠多克隆抗体OSM及OSMR于4 ℃过夜。再分别加入二抗羊抗大鼠IgG室温30 min,再次加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,室温孵育30 min,PBS漂洗3次;然后加入DAB室温显色1-2 min,光镜下观察着色情况,蒸馏水漂洗;再分别加入苏木精染料2 min,1%氨水返蓝,常规脱水、透明、封片并用显微镜成像系统采集图片,OSM及OSMR免疫组化染色切片在光镜下放大400倍,生物医学图像分析系统分析;OSM及OSMR免疫组化染色切片在光镜下放大400倍观察病理改变。

但是，实际上此时国民党顽固派开始掀起了第二次反共高潮，救国会也因亲共而受到打击。宪政运动已完全消沉。1940年5月初，参谋总长兼军政部长何应钦竟在国防最高会议上诬指沙千里、沈钧儒和邹韬奋企图于“七七”抗战纪念日在重庆领导暴动；如“七七”不成，在10月10日“双十节”再暴动。显然，这是一次有计划的迫害。由于沙千里等及时揭露和斗争，何应钦之流才没有得逞。但是，一大群无辜青年因此而受到牵连，惨遭迫害。

图2 两组大鼠肾脏组织OSM及OSMR表达 (×400)Figure 2 Expression of OSM and OSMR in kidney tissues of rats in the two groups (×400)

2.5 两组大鼠肾组织内JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达结果比较

1.2.3 HE及PAS染色观察肾脏病理改变 处死大鼠,股主动脉取血后,同时给予4 ℃预冷的生理盐水肾脏灌注后,取肾脏称质量,将每只大鼠的一个肾脏置于4%多聚甲醛固定,以便制作石蜡切片,常规HE、PAS染色,观察肾小球和肾小管间质病理改变。另一个肾脏组织置于液氮中,冻透后转入-80 ℃冰箱保存备用。

与对照组相比,*P<0.05图3 Western blot检测两组大鼠肾脏组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达Figure 3 JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 protein expression in renal tissues of rats in the two groups by Western blot

2.6 肾脏组织中OSM及OSMR蛋白与24 h尿蛋白定量的相关性分析

高脂组肾脏组织中OSM蛋白的表达与24h尿蛋白定量表达呈高度正相关关系(r=0.979,P<0.01),肾脏组织中OSMR蛋白的表达与24 h尿蛋白定量表达呈高度正相关关系(r=0.963,P<0.01,见图4)。

图4 OSM、OSMR蛋白的相对表达与24 h尿蛋白定量的相关性分析Figure 4 Correlation of relative expression of OSM and OSMR proteins with 24 h urinary protein quantification

3 讨论

近年来,随着人们生活水平的提高,高脂血症发生率不断升高。脂质是一切细胞存活的基本组成成分。大多数细胞具有复杂的结构来调解脂质的进入、合成、储存、利用与输出。脂质过分堆积在细胞,超过细胞处理能力,将导致细胞损伤与功能障碍。目前越来越多的临床及动物实验研究证实,“脂质具有肾毒性”这一假说,之后一些学者推断脂质可以导致肾小球系膜增殖,肾小管上皮细胞损伤,从而促进肾脏疾病的进展[6,7]。但脂质导致肾小管间质损伤可能的细胞信号通路及相关因子目前研究报道甚少。

JAK/STAT信号通路是机体内非常重要的一条由细胞因子刺激的信号转导通路,大多数细胞因子主要通过JAK/STAT信号通路发挥其生物学功能。JAK/STAT信号通路的缺陷或异常活化与脂质肾损害的发生发展及预后有着密不可分的关系[8]。JAK是一种生长调节因子,主要由活化的T淋巴细胞和单核巨噬细胞分泌[9]。OSM具有多种生物学功能,如促进和抑制炎症反应,促进组织修复再生,刺激造血,调节细胞生长及分化等。OSM也可广泛作用于体内外各种细胞,表现出多种生物学活性。由于OSM与白细胞介素6家族成员中的白血病抑制因子(LIF)在结构和功能上十分接近,研究证实,OSMR I型为OSM与LIF所共用。有研究报道OSM/OSMR参与调节急性肾功不全肾小管急性损伤,是肾小管急性炎症反应的重要预测指标。该研究还发现OSM能通过上调LIF/LIFR促进肾小管上皮细胞修复[10]。除此之外,最近体外研究亦发现OSM/OSMR能通过激活Jak/Stat及ERK1/2信号通路诱导人肾小管上皮细胞间充质转分化参与肾间质纤维化。近年来国内外研究报道OSM及其受体OSMR参与多种肾脏疾病的发生及发展[11]。目前相关的研究发现参与此通路的细胞因子众多,本课题组通过建立高脂血症大鼠模型,12周时测大鼠血清总胆固醇、甘油三脂及24 h尿蛋白定量较对照组明显升高,而内生肌酐清除率未见明显差异;肾脏病理HE及PAS染色提示肾小球系膜细胞增殖明显,系膜基质增多,肾小管上皮细胞浊肿,肾间质可见以巨噬细胞为主的炎性细胞大量浸润,这些和既往国内外报道的脂质肾损伤病理改变一致。JAK/STAT信号通路参与多种生物学过程,如细胞增殖、分化及免疫调节等。该信号通路的传递过程主要由3部分组成,即酪氨酸激酶相关受体(receptor tyrosine kinases,RTKs)、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。作为重要的信号转导与转录因子,STATs参与了多重生物学过程,如细胞分化、免疫、应答机胚胎发育等,其中包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6这7个成员[12]。STAT3具有2个酪氨酸磷酸化位点(Y701和705)和1个丝氨酸磷酸化位点(S727),SH2结构域能特异性识别磷酸化酪氨酸残基,从而使含有该结构域的蛋白质定位于酪氨酸磷酸化位点。STAT3可被受体相关的Janus激酶磷酸化,形成同源或异源二聚体,并易位至细胞核[13]。STAT3通过其特殊的SH2结构域与受体上的磷酸化酪氨酸残基结合,并在JAK激酶的作用下实现其C端酪氨酸残基的磷酸化,进而启动一系列的信号转导,最终导致基因表达或其他细胞学反应[14]。本实验中通过ELISA方法检测到高血脂血症大鼠血清中OSM大量分泌,同时免疫组化法提示肾小管上皮细胞大量表达OSM,而组织蛋白印迹法进一步证实,高脂血症大鼠肾脏组织中大量表达p-JAK2,p-STAT3,上述结果均提示JAK2/STAT3信号通路活化可能参与在脂质肾损害过程中。

回去后，马丽亚跟海力发生了争吵。为了把竹韵从海力身边推开，她暗暗怂恿自己的亲信散布流言蜚语，说竹韵勾引老板，一场老板跟员工的绯闻就这样有声有色地掀了起来……

本实验除发现高脂血症可诱导SD大鼠肾小球系膜细胞增殖,肾小管-间质炎性细胞浸润及肾小管上皮细胞浊肿等肾脏损伤和国内外报道一致外,更重要的是p-JAK2/p-STAT3在高脂血症大鼠肾脏组织中大量表达,STAT3磷酸化后进一步启动下游信号转导,从而参与脂质肾损害病理过程,进一步推测OSM可能是其上游因子参与该过程,但尚需要体外实验进一步证实,以期为脂质肾损害发病机制提供新的伦理依据。