抗乙酰基转移酶TIP60单克隆抗体的制备与鉴定

刘树玲,赵陶然,陆 昕,米腊腊,赵兴卉,刘志贞*

(1军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京 100071;2山西医科大学基础医学院,出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室;3山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室;4山西医科大学基础医学研究中心;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:zhizhenliu2013@163.com;**共同通讯作者,E-mail:xinghui-zhao@163.com)

Tat相互作用蛋白60(Tat-interactive protein 60,TIP60)也称作KAT5或HTATIP,是乙酰基转移酶MYST(MOZ,YBF2,SAS2和TIP60)家族的成员之一。TIP60蛋白由N端染色质桶装结构域(TIP60-CB)和C端乙酰化结构域构成,其中C端乙酰化结构域中含有一段保守的MYST乙酰基转移酶结构域,该结构将乙酰基从乙酰CoA转移到底物赖氨酸的α-氨基上[1],实现蛋白的乙酰化修饰。

TIP60能够催化一系列组蛋白的乙酰化,如H2A的K5,H3的K14,H4的K5、K8、K12、K16,但并不能乙酰化H2B[2]。除此之外,TIP60还可以乙酰化一系列转录因子及DNA损伤反应相关蛋白,如c-Myc[3]、STAT3[4]、E2F1[5]、ATM[6]、C/EBPα[7]和p53[8]等。因此,TIP60在DNA损伤修复[9,10]、检查点激活[6]、p53指导的细胞凋亡[11,12]、衰老和自噬[13]等过程中发挥关键作用。此外,TIP60还在Ras/p38信号传导[14]和胰岛素/AKT信号传导[15]等信号转导途径中起着重要的中介作用[16]。

我们在TIP60与转录因子相互作用的研究中,为了检测细胞内的TIP60蛋白水平以及免疫共沉淀捕获TIP60相互作用蛋白,使用商品化的抗TIP60抗体,但效果均不理想。为了解决这一问题,我们分析了TIP60蛋白结构,选取N端一段氨基酸序列合成多肽,作为抗原免疫小鼠,并通过亲和层析纯化,成功制备了抗TIP60单克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

雌性8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自Sigma-Aldrich(USA)公司,骨髓瘤细胞(SP2/0)、293T细胞、大鼠巨噬细胞RMa-bm、小鼠巨噬细胞RAW264.7为本室保存。胎牛血清、DMEM培养基为Gibco(USA)公司产品。HAT培养基和HT培养基按常规配制。硝酸纤维膜为Millipore(USA)公司产品。HRP标记的羊抗小鼠二抗为Abcam(USA)公司产品。Pierce ECL Western Blotting Substrate印记检测试剂为Thermo Fisher(USA)公司产品。Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit为Roche(USA)公司产品。

1.2 抗原肽段制备

通过TIP60结构分析,确定用于小鼠免疫的表位序列为N端11-30号氨基酸残基CRLPVLRRNQDNEDEWPLAE,为了增加多肽的免疫原性,在N端进行血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)修饰。多肽的合成与修饰委托南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3 动物免疫

将制备好的KLH修饰多肽与弗氏完全佐剂充分混合,在每只小鼠腹股沟皮下多点注射20 μg(共免疫3只小鼠),2周和4周后分别以KLH修饰多肽加弗氏不完全佐剂加强免疫一次,方法同首次免疫。融合前3 d再次加强免疫一次。

1.4 杂交瘤细胞制备与单克隆筛选

无菌条件下取免疫小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,与Sp2/0骨髓瘤细胞融合后,接种于预先加入滋养细胞的96孔培养板中用HAT选择培养基培养,融合后第4天更换培养液,换液时吸去全部培养液,加入200 μl新鲜含HAT的培养液。观察细胞克隆长至1/3-1/2培养孔面积时,对细胞培养上清进行检测,筛选阳性克隆。初次克隆时换HT培养液,用有限稀释法进行亚克隆化,连续亚克隆3次以上,阳性率达100%。

1.5 单克隆抗体腹水制备及检测

腹水制备前1个月给小鼠腹腔注射石蜡油(0.5 ml/只)。用筛选出的阳性克隆杂交瘤细胞悬液对小鼠腹腔注射(1×106细胞/只)诱导腹水产生。5-6 d后收集小鼠腹水,然后用蛋白G柱(GE公司,USA)纯化抗体,并于-20 ℃保存备用。

1.6 抗体亚型鉴定

收集杂交瘤细胞表达上清,用PBST稀释100倍后,加入预包被抗小鼠不同Ig亚型抗体的酶标板(上海博湖生物技术有限公司)孔中,每孔50 μl,再加入HRP标记的羊抗鼠IgM抗体每孔50 μl。混匀后室温孵育1 h。倒掉板中液体,充分清洗后加入显色剂显色,显色最深的孔为相应抗体亚型。

1.7 Western blot法检测抗体特异性

收集过表达人TIP60蛋白的293T细胞、大鼠巨噬细胞或小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,提取细胞全蛋白,经过SDS-PAGE电泳后,将蛋白转印在硝酸纤维膜,用5%脱脂奶粉(溶于TBST溶液)封闭后,用杂交瘤细胞培养上清作为一抗、或商品化的抗TIP60抗体室温孵育2 h,TBST洗3次后,加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗孵育,用ECL显色后观察抗体结合效果。

1.8 免疫共沉淀及质谱样品制备

收集培养的人肝癌细胞HepG2细胞,提取细胞全蛋白,加入2 μg纯化后的anti-TIP60 mAb,4 ℃孵育1 h,之后加入20 μl蛋白A/G凝胶颗粒,4 ℃颠倒孵育2 h。孵育结束后,离心收集凝胶颗粒并清洗两次2次。用0.1 mol/L甘氨酸(pH3.5)将凝胶颗粒上捕获的蛋白洗脱下来,中和后用0.1 mol/L DTT还原蛋白种的二硫键,然后用吲哚乙酸(溶于50 mmol/L NH4HCO3,终浓度为50 mmol/L)烷基化,最后用加入1%甲酸将样品酸化后,送去质谱检测。

2 结果

2.1 TIP60蛋白的抗原表位预测

通过uniport数据库获取人TIP60蛋白的信息,该蛋白现有的不完全晶体结构数据显示,TIP60蛋白N端的染色质结合结构域1-80位氨基酸中含有4个β片层,3个α螺旋,其中,b1和b2之间形成一个特殊的发卡结构(见图1A),而C端乙酰化结构域227-506位氨基酸中含有13个β片层,9个α螺旋(见图1B)。通过DNAstar-protean软件分析TIP60蛋白的氨基酸序列分布情况显示该蛋白整体亲水性较强(见图1C)。基于以上信息,选择TIP60 N端包含发卡结构的11-30位氨基酸(图1A红色区域、图1C红框区域)这段包含暴露在二级结构外的、具有较强亲水性的多肽序列作为抗原序列。

图1 DNAstar-protean软件预测TIP60抗原表位Figure 1 TIP60 epitope prediction by DNAstar-protean

2.2 杂交瘤细胞株的建立

取免疫后小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞,经细胞融合和初步筛选后,共获得8株单克隆细胞株。通过Western blot检测8株单克隆细胞株的培养上清中的抗体,是否能识别293T细胞中过表达的人TIP60蛋白。在293T细胞中转染HA-TIP60过表达质粒,待目的基因表达后,收集细胞提取全蛋白,通过电泳转膜和ECl显影,结果显示,2#、4#、5#、6#、7#和8#单克隆细胞株产生的抗体在稍低于70 kD处有条带,但是只有4#条带最为明显和单一(见图2)。

图2 Western blot法鉴定单克隆细胞株培养上清对293T细胞中过表达的人TIP60蛋白的结合Figure 2 Identification of the binding of the culture supernatant of the monoclonal cell line to human TIP60 protein overexpressed in 293T cell by Western blot

2.3 抗体亚型的鉴定

通过小鼠亚类鉴定试剂盒鉴定后,抗体亚型为IgG1型。

2.4 鉴定TIP60在细胞内蛋白相互作用

为了进一步验证获得的抗体对TIP60蛋白的识别,以及研究TIP60在细胞中相互作用的蛋白,利用获得的4# aiti-TIP60 mAb包被蛋白A/G凝胶颗粒,与HepG2细胞裂解液共同孵育富集TIP60及其相互作用蛋白,将获得的蛋白复合物进行质谱检测。结果显示,免疫共沉淀复合物中丰度最高的成分为TIP60(同工酶3),共鉴定到12个特异性肽段,此外还有多种核蛋白及核糖体蛋白(见表1)。

表1 质谱鉴定4# aiti-TIP60 mAb在HepG2细胞中所捕获蛋白

2.5 抗体种属特异性的鉴定

在TIP60的研究中,小鼠和大鼠及这两种动物来源的细胞都是常有的实验模型,通过BLAST比对,发现人(Q92993)和大鼠(Q99MK2)以及人(Q92993)和小鼠(Q8CHK4)的TIP60基因序列的一致性高达99.8%(见图3),这提示人、大鼠和小鼠来源的TIP60蛋白可能具有较高的结构相似性。

图3 人(Q92993)和大鼠(Q99MK2)以及人(Q92993)和小鼠(Q8CHK4)的TIP60基因序列比对Figure 3 TIP60 gene sequence alignment between human(Q92993) and rat(Q99MK2) as well as human(Q92993) and mouse(Q8CHK4)

进一步收集大鼠巨噬细胞和小鼠巨噬细胞,提取全蛋白,4#mAb检测其中的TIP60蛋白,通过电泳转膜和ECl显影,结果显示,这株抗体能够特异性识别大鼠和小鼠细胞内源性产生的TIP60蛋白(见图4)。

图4 Western blot法鉴定单克隆细胞株培养上清对大鼠巨噬细胞和小鼠巨噬细胞TIP60蛋白的结合Figure 4 Identification of the binding of the culture supernatant of the monoclonal cell line to the TIP60 protein in rat macrophages and mouse macrophages by Western blot

3 讨论

人类TIP60蛋白有多种剪切体,本研究通过uniport数据库获取人TIP60氨基酸序列,运用生物信息学的方法通过DNAstar-Protein软件、分析TIP60蛋白亲水性、表面可及性和抗原指数,结合该蛋白部分PBD结构信息,选择保守序列N端11-30位氨基酸作为抗原表位区。合成多肽序列并偶联KLH修饰作为抗原,通过免疫小鼠,并构建融合瘤细胞,获得了8个单克隆细胞株。通过SDS-PAGE电泳分离和Western blot初步鉴定筛选出4#单克隆细胞株,它产生的抗体在60 kD左右的位置产生特异条带。用4#单克隆细胞株刺激小鼠产生腹水,纯化腹水得到单克隆抗体4# anti-TIP60 mAb。通过质谱检测4# anti-TIP60 mAb所捕获的HepG2细胞蛋白,鉴定到了丰富的TIP60特征肽段。这进一步证明4# anti-TIP60 mAb对TIP60蛋白的特异性。由于人、大鼠和小鼠物种之间的TIP60蛋白具有较高的同源性,本研究获得的4# anti-TIP60 mAb能够与上述三种物种细胞内源性产生的TIP60反应。这株高特异性、多物种反应性的抗TIP60抗体的制备,可以为TIP60生物功能研究提供可靠的帮助。

总之本研究通过生物信息学方法预测TIP60蛋白的抗原表位,合成KLH修饰的多肽序列,通过免疫小鼠、筛选细胞单克隆筛选获得一株分泌TIP60抗体的杂交瘤细胞,经过质谱鉴定证明这株抗体可以准确结合TIP60蛋白。此外,这株抗体可以识别人、大鼠、小鼠来源的TIP60蛋白。