多巴胺1类受体活化减轻心力衰竭早期炎症反应的实验研究

武栗妃,马友才,王 霞,阚晓玉

(1山西医科大学病理生理教研室,太原 030001;2首都医科大学附属北京安贞医院急诊科;3首都医科大学病理生理教研室;4首都医科大学附属北京安贞医院血液科;*通讯作者,E-mail:wifi04151127@163.com)

心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段,发病率和病死率极高。炎症反应在心力衰竭的发生发展中具有重要的作用[1-3]。炎症因子的水平与心力衰竭的不良预后具有明显的相关性[1-4]。多巴胺及多巴胺受体除了在神经系统疾病中发挥作用,在心血管系统中也具有重要的作用,临床上多巴胺多用于急性心力衰竭的治疗[5]。多巴胺通常作用于多巴胺受体(DR)发挥作用,包括D1和D2类受体。D1类受体由D1R和D5R组成,活化后可激活腺苷酸环化酶的活性;D2类受体由D2R、D3R和D4R,活化后抑制腺苷酸环化酶的活性[6,7]。以往研究发现多巴胺通过作用于多巴胺1类受体抑制系统性炎症反应在脓毒症中发挥保护作用[8]。此外,多巴胺1类受体可以调节免疫细胞的功能在自身免疫性疾病中具有重要作用[9]。然而多巴胺1类受体是否调控炎症反应进而参与心力衰竭的发病过程目前尚不清楚。本研究通过横向主动脉弓缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)建立心力衰竭的模型,观察给予多巴胺1类受体的激动剂非诺多泮对心力衰竭早期炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 为了观察多巴胺受体在心力衰竭小鼠心脏中表达的变化,健康雄性清洁级C57BL/6J小鼠20只,8周龄,体质量20-22 g,购自北京斯贝福实验动物科技有限公司。随机分为两组:①假手术组:开胸不做横向主动脉弓缩窄术,喂养6周;②TAC组:TAC术后喂养6周。为观察多巴胺受体5激动剂非诺多泮对TAC早期心脏炎症反应的影响,健康雄性C57BL/6J小鼠40只,按随机数字表随机分为以下4组:①假手术联合磷酸盐缓冲溶液(PBS)组:开胸不做横向主动脉弓缩窄术,手术后立即腹腔注射PBS,按10 mg/kg,每天1次,连续注射1周;②假手术联合非诺多泮组:手术后立即腹腔注射非诺多泮,按10 mg/kg,每天1次,连续注射1周;③TAC联合PBS组:TAC术后立即腹腔注射PBS,按10 mg/kg,每天1次,连续注射1周;④TAC联合非诺多泮组:手术后立即腹腔注射非诺多泮,按10 mg/kg,每天1次,连续注射1周。每组10只小鼠,以上分组均为普通饮食,自由饮水饮食。

1.1.2 主要仪器与试剂 NIS-ELEMENTS定量分析软件,ECLIPSE 90i显微镜(Nikon,日本),蜡块包埋机(Leica,德国),Vivid 7小动物超声心动仪(GE Healthcare,英国),NanoDrop spectrophotometer(Thermo Scientific,美国)。非诺多泮(Sigma,美国),D5R抗体(Santa Cruz biotechnology公司,美国),3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)购自中杉抗体公司;反转录试剂盒(Agilent Technologies,美国),SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 TAC模型的制备 采用横向主动脉弓缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)的方法,设立假手术组。具体方法为:将小鼠用1%戊巴比妥钠将小鼠麻醉,使其仰卧位固定于手术台,在显微镜下,从颈部正中线处切开皮肤暴露胸腔部位,从胸骨左上第二肋间进入胸腔,将胸腺移开视野暴露主动脉弓,在分离的头臂干和左颈总动脉之间的横向动脉弓平行的部位,将其用7-0丝线和27号针头紧紧地绑在一起,然后立即去掉针头,这样就缩窄成直径为0.4 mm的动脉[10]。手术后7 d,测定主动脉弓血流峰值情况,大于2 000 mm/s表明手术成功,待TAC术后1周测定心功能,之后于麻醉状态下断颈处死小鼠。

1.2.2 心功能测定 TAC术后1周测量小鼠心脏功能;小鼠用3%异氟烷(isofluorane)麻醉直到心率稳定在每分钟400-500次。使用40 MHz探头高解析度微型超声波系统测量得到收缩期、舒张期以及左室前后壁的二维短轴图像。射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)分别计算使用Vevo分析软件(版本2.2.3)。所有测试对象均采用相同技术参数,并至少测量5个连续周期,取其平均数[10,11]。

1.2.3 组织病理切片及HE(苏木精-伊红染液)染色 用含有肝素的0.9%氯化钠注射液灌注心脏后剪下整个心脏浸泡于福尔马林固定24 h,制作石蜡切片。苏木素伊红染色程序及结果判定参见试剂盒说明书(Solarbio公司)。采用尼康电子显微镜(N90i)采集图像[12]。

1.2.4 组织病理切片及免疫组织化学染色 用含有肝素的0.9%氯化钠注射液灌注心脏后剪下整个心脏浸泡于福尔马林固定24 h,制作石蜡切片。采用免疫组织化学法染色观察心脏组织炎症细胞浸润。免疫组织化学法的染色程序及结果判定参见试剂盒说明书(迈新公司)。采用尼康电子显微镜(N90i)采集图像[12]。

1.2.5 real-time PCR法 检测TAC术后6周心脏多巴胺受体1-5 mRNA水平及TAC术后1周心脏炎症相关因子的mRNA表达。每组各取5只TAC术后小鼠,收取整个心脏组织,Trizol法抽提总RNA。测定RNA纯度、浓度,后反转为cDNA,进行real-time PCR[13]。反应条件为:反应温度95 ℃ 5 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 45 s(45循环);熔解曲线:55 ℃→95 ℃(升高0.5 ℃/cycle,81循环)。使用软件自行设计引物,由上海生工公司合成(见表1)。

表1 基因名称和引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 多巴胺受体在TAC术后6周心脏中的表达

实时荧光定量PCR可见,与假手术组比较,TAC组心脏多巴胺受体1、多巴胺受体3及多巴胺受体4在心脏的表达没有变化;多巴胺受体2水平降低,多巴胺受体5的水平升高(见图1A)。免疫组化结果可见,与假手术组比较,TAC组多巴胺受体5在心脏的表达水平明显升高(见图1B)。

图1 多巴胺受体在TAC术后6周心脏中的表达Figure 1 The expression of dopamine receptor in heart at week 6 after TAC

2.2 横向主动脉弓成功指标评价

横向主动脉缩窄术后1周,多普勒超声模式下,结扎处可见彩色血流信号,血流速度增加,血流速度峰值可达2 000 mm/s以上(见图2)。假手术组小鼠主动脉弓左颈总动脉与头臂干之间血流速度为800 mm/s(见图2)。

图2 横向主动脉术弓缩窄术后1周的超声影像图Figure 2 Ultrasound image at week 1 after TAC

2.3 四组术后1周心脏炎症细胞浸润及炎症因子水平

与假手术+PBS组比较,TAC+PBS组术后1周心脏浸润的炎症细胞明显增多;与TAC+PBS组比较,TAC+非诺多泮组心脏炎症细胞的浸润减少(见图3A)。与假手术+PBS组比较,TAC+PBS组术后1周心脏炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平明显升高(4.18±0.31vs10.14±0.99,P<0.05;3.79±0.08vs14.43±2.35,P<0.05);与TAC+PBS组比较,TAC+非诺多泮组心脏炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平明显降低(10.14±0.99vs4.19±0.47,P<0.05;14.43±2.35vs4.36±0.72,P<0.05,见图3B)。

2.4 四组术后1周的心功能比较

与假手术+PBS组比较,TAC+PBS组术后1周心脏射血分数与短轴缩短分数无明显变化(P>0.05);与TAC+PBS组比较,TAC+非诺多泮组术后1周心脏射血分数和短轴缩短分数无明显的变化(P>0.05,见图4,表2)。

与假手术+PBS组比较,#P<0.05;与TAC+PBS组比较,*P<0.05B.实时荧光定量PCR检测横向主动脉弓缩窄术后1周心脏炎症因子的水平图3 四组小鼠术后1周心脏炎症细胞浸润及炎症因子水平Figure 3 Infiltration of inflammtory cells and mRNA levels of inflammatory factors in heart at week 1 after operation in four groups

表2 四组小鼠术后1周射血分数与短轴缩短分数比较 (%)

3 讨论

各种心脏疾病发展到晚期均会出现心力衰竭,持续的炎症反应促进心力衰竭的发展进程。炎症细胞及炎症介质介导的炎症反应导致心肌肥大、心肌细胞凋亡,心肌纤维化最终发生病理性心肌重塑[14]。炎症介质水平增高与心力衰竭不良预后有关。神经系统通过释放神经激素或神经递质影响免疫功能[1]。目前越来越多的证据表明神经系统和神经递质在炎症反应中具有重要的调节作用[15]。多巴胺及其受体除了在中枢神经系统中具有重要的作用,在损伤或感染所致的系统性炎症反应及心血管疾病中也具有重要的作用。多巴胺或受体的激动剂作用于多巴胺受体能够调节免疫细胞的活化、增殖和细胞因子的产生。肾脏多巴胺受体具有调节血压的作用[12,16]。有研究表明心脏特异性过表达腺苷酸环化酶可以改善心肌病小鼠的心功能。腺苷酸环化酶用于心力衰竭的治疗目前在进行临床试验[17,18]。抑制磷酸二酯酶2而增加cAMP的水平可以阻止心肌肥厚[19]。此外,cAMP活化的PKA使其底物组蛋白脱乙酰酶磷酸化具有心肌细胞肥大的作用[20,21]。因此本实验提出假设:作为cAMP-PKA的上游,多巴胺1类受体(多巴胺受体1和多巴胺受体5)活化可以减轻心力衰竭早期的炎症反应。

在本实验中,使用实时荧光定量PCR检测心力衰竭小鼠心脏组织中多巴胺受体的mRNA水平,结果发现与假手术组相比,多巴胺受体1、多巴胺受体3与多巴胺受体4的水平没有改变,多巴胺受体2的mRNA水平降低,多巴胺受体2在心力衰竭中的作用以往有文献报道。多巴胺受体5水平明显升高。为了进一步验证多巴胺受体5在心力衰竭中的改变,我们通过免疫组化方法观察心力衰竭小鼠心脏多巴胺受体5的表达,与对照组相比,该受体的表达明显增多,提示多巴胺受体5参与心力衰竭的发生发展。为了研究多巴胺受体5在心力衰竭早期炎症反应中的作用,我们采用横向主动脉弓缩窄术后1周的小鼠,心脏多普勒超声检查横向主动脉弓缩窄术后1周血流峰值,结果可以看到横向主动脉缩窄术后血流峰值可达2 000 mm/s,而假手术组血流峰值为800 mm/s,提示横向主动脉弓缩窄术成功。横向主动脉弓缩窄术小鼠腹腔连续注射非诺多泮1周观察其对炎症反应的影响,结果发现与对照组相比,非诺多泮明显减少心脏炎症细胞的数量及炎症介质的水平。提示多巴胺受体具有抑制心力衰竭早期心脏的炎症反应。我们同时观察非诺多泮对心力衰竭早期心功能的影响,与对照组相比,反应心功能的射血分数与短轴缩短分数没有明显的变化。以上结果提示多巴胺受体5在心力衰竭的早期主要介导心脏的炎症反应。

本研究发现多巴胺受体5活化后可以抑制心力衰竭早期炎症反应,多巴胺受体5对心力衰竭晚期心肌肥厚及心肌纤维化是否有影响,我们将在多巴胺受体5转基因小鼠中进行深入研究,本研究首次发现了多巴胺受体5在心血管疾病中的新作用,可能为心力衰竭的临床治疗提供一定的理论和实践依据。