饲用益生菌凝结芽孢杆菌抑菌性能的研究

柳成东，肖明霞，李琦华，程志斌

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201）

我国农业农村部（第194 号公告）定于2020 年7月1 日起全面禁止促生长药物饲料添加剂的使用，包括饲用益生菌等诸多替抗类产品的筛选及应用成为重要研究方向[1]。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是分泌乳酸的芽孢杆菌属益生菌，近年来成为研究热点[2]。已有动物饲养试验显示，饲粮中添加单一凝结芽孢杆菌能通过抑制大肠杆菌、沙门氏菌等肠道主要有害菌，显著改善畜禽生长性能[3-5]；也有报道称，凝结芽孢杆菌与其他饲用益生菌组合的饲喂效果低于单一凝结芽孢杆菌[3,6]。由此可见，饲用益生菌等添加剂替抗的动物饲养试验易受试验动物、试验场地、试验条件等因素的影响，试验结果重复性不稳定[7-8]，且动物饲养试验的周期较长、费用高。因此，针对凝结芽孢杆菌等替抗产品性能的初步筛选，建立科学、高效的体外实验室评估方法，有助于提高动物饲养试验的研发效率和可重复性[7-8]。

牛津杯法已用于凝结芽孢杆菌的体外抑菌性能评估[9-15]，然而现有的报道存在2 个问题：其一，凝结芽孢杆菌抑菌作用的研究不系统。目前，凝结芽孢杆菌对肠道有害菌[12-15]及饲料源有害菌[9,12]抑制作用的研究较多，对多种商业饲用益生菌的抑制研究报道较少[9-10,12]，且对乳酸杆菌等肠道有益菌的抑制研究没有报道；其二，凝结芽孢杆菌的抑菌效果不明确。已报道的凝结芽孢杆菌牛津杯法抑菌试验均没有设计抗生素对照组，这不利于比较确定凝结芽孢杆菌的抑菌效果。据此，本研究以广谱抗菌药物饲料添加剂金霉素和土霉素为参照，采用牛津杯法较为系统地评估凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌、肠道有益菌、饲料源有害菌、商业饲用益生菌等的抑菌作用及效果，为其在畜禽生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

试验中11 个指示菌包括4 类。肠道有害菌：大肠杆菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大肠杆菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）、鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）；肠道有益菌：罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）；饲料源有害菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusBNCC186335）；商业饲用益生菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、屎肠球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、粪肠球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、产朊假丝酵母（Candida utiliBNCC336517）。以上菌株购买自北纳创联生物科技有限公司和北京百欧博伟生物科技有限公司。

1.2 试验设计 设金霉素组、土霉素组、凝结芽孢杆菌组3 个处理组，采用牛津杯法对比评估凝结芽孢杆菌对以上4 类11 个指示菌的抑制效果。

1.3 牛津杯抑菌试验步骤及抑菌作用判定

1.3.1 凝结芽孢杆菌及指示菌的培养 凝结芽孢杆菌培养参考课题组前期报道[16]；指示菌大肠杆菌K88 和K99、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等采用LB 培养基培养；指示菌罗伊氏乳酸杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母等采用MRS 培养基培养。

1.3.2 指示菌涂布平板制备 将涂布平板所用的MRS 固体培养基在121℃灭菌30 min，冷却至45℃后倒入无菌培养皿[14]。凝固后，待水分干燥，即可涂布。

1.3.3 指示菌液稀释涂布 ①将培养24 h 的大肠杆菌K88 和K99、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌液吸取800 µL，转入装有7.2 mL 无菌水的EP 管，进行梯度稀释至10-5涂布。每次操作，每个指示菌涂3 个培养皿（3 次平行测定）。②将培养24 h 的伊氏乳酸杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌液吸取800 µL，转入装有7.2 mL 无菌水的EP 管，进行梯度稀释至10-3涂布。每次操作，每个指示菌涂3 个培养皿（3 次平行测定）。

1.3.4 牛津杯抑菌测定 为统计比较3 个处理组（金霉素，I 组；土霉素，II 组；凝结芽孢杆，III 组）对某一个指示菌的抑制效果，每个指示菌吸取200 µL 涂布1个培养皿，并在每个培养皿中放置3 个牛津杯，分别用于加入100 µL 的金霉素、土霉素、凝结芽孢杆菌菌液。然后，37℃恒温培养24 h[14]，之后测定抑菌圈直径（Diameter of Inhibition Zone，DIZ）。以抑菌圈直径最大值和最小值的平均值确定抑菌圈直径，并用于抑菌作用判定和抑菌效果比较分析。

1.3.5 抑菌作用判定方法 凝结芽孢杆菌抑菌作用判定目前尚无统一标准，本研究参考李静舒等[15]报道，并依据所用牛津杯的直径值（7.8 mm），将牛津杯外径的约2 倍16.0 mm 区分为“敏感”与“高敏感”，因此判定设定标准：“不敏感”，DIZ=7.8 mm；“敏感”，7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm；“高敏感”，DIZ＞16.0 mm。

4.应有落地问题上的挑战。工信部信息中心此前发布的《2018年中国区块链产业白皮书》显示，截至2018年3月底，我国以区块链为主营业务的区块链公司数量已超过450家，中国区块链产业初步形成规模。但这其中大部分的项目无法落地。

1.4 统计分析 对处理组之间的抑菌圈直径数据进行单因素方差分析和LSD 多重比较，P＜0.05 表示差异显著，分析采用SAS9.4 统计软件。

2 结果

2.1 凝结芽孢杆菌对肠道主要有害菌的抑制作用 表1和图1 可知，凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用达到“高敏感”（DIZ=19.8 mm）；相反，金霉素和土霉素对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用判定为“不敏感”（DIZ=7.8 mm）。凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K99 的抑制作用达到“敏感”（7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm），且与金霉素、土霉素的抑菌作用差异不显著（P＞0.05）。凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88 和鸡白痢沙门氏菌的抑制作用也达到“敏感”（7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm），然而其抑制作用小于（P＜0.05）金霉素和土霉素。由此可见，4 个肠道主要有害菌中，凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制效果最显著。

表1 凝结芽孢杆菌与金霉素、土霉素对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用 mm

图1 凝结芽孢杆菌对肠道主要有害菌的抑制效果

2.2 凝结芽孢杆菌对肠道主要有益菌乳酸杆菌的抑制作用 由图2 可知，凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌乳酸杆菌（罗伊氏乳酸杆菌）抑菌作用，判定为“不敏感”（DIZ=7.8 mm）；相反，金霉素、土霉素对罗伊氏乳酸杆菌的抑菌圈直径分别为24.3 mm、24.1 mm，判定为“高敏感”。

图2 凝结芽孢杆菌与金霉素、土霉素对畜禽肠道主要有益菌罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用

2.3 凝结芽孢杆菌对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用 由图3 可知，凝结芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为14.7 mm，判定为“敏感”；且抑制效果小于金霉素（DIZ=28.6 mm，高敏感）和土霉素（DIZ=28.4 mm，高敏感）（P＜0.001）。

图3 凝结芽孢杆菌与金霉素、土霉素对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.4 凝结芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用由表2 和图4 可知，凝结芽孢杆菌对粪肠球菌、产朊假丝酵母的抑制作用，判定为“不敏感”。凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌的抑制作用达到“敏感”（DIZ=11.3 mm），且抑制作用小于金霉素（DIZ=14.0 mm）（P＜0.001），但大于土霉素（DIZ=9.6 mm）（P＜0.001）。凝结芽孢杆菌对地衣芽孢杆菌、屎肠球菌的抑制作用也达到“敏感”，且抑制作用小于金霉素和土霉素（P＜0.001）。

图4 凝结芽孢杆菌对商业饲用益生菌的抑制效果

表2 凝结芽孢杆菌与金霉素、土霉素对主要商业饲用益生菌的抑制作用 mm

3 讨 论

3.1 凝结芽孢杆菌对肠道主要有害菌的抑制作用 猪霍乱沙门氏菌感染易引发仔猪副伤寒，是养猪生产中常见的肠道传染病之一，导致仔猪严重下痢和败血症，病死率高[17]。本研究中，凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用判定为“高敏感”。严涛等[13]报道，从泡菜中分离的5 株凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌均有较强的抑制作用，这与本试验结果一致。相反，广谱抗菌药物金霉素、土霉素对猪霍乱沙门氏菌无抑制作用。王俊红[17]发现猪霍乱沙门氏菌对土霉素有较强耐药性。以上表明，相比于金霉素、土霉素对猪霍乱沙门氏菌无抑制作用的结果，凝结芽孢杆菌具有开发应用于预防与治疗仔猪副伤寒的潜力。

大肠杆菌K88、大肠杆菌K99 和鸡白痢沙门氏菌是畜禽肠道最常见的致病菌，严重引发猪、鸡腹泻，降低生产性能[18-19]。本研究结果显示，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99 和鸡白痢沙门氏菌的抑制作用均为“敏感”。汪攀等[14]采用牛津杯法研究结果也显示，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K99 具有显著的抑制作用。本研究首次发现，凝结芽孢杆菌抑制大肠杆菌K99 的效果等同于广谱抗菌药物土霉素，且强于金霉素。此外，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88 和鸡白痢沙门氏菌有抑制作用，这与前人的报道基本一致[11,14]，且本研究进一步证明了凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88 和鸡白痢沙门氏菌的抑制效果弱于金霉素和土霉素。

以上分析综合表明，凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制效果优于广谱抗菌药物金霉素和土霉素，对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99 和鸡白痢沙门氏菌有显著抑制作用。因此，针对畜禽肠道主要有害菌而言，饲用益生菌凝结芽孢杆菌具有替代抗生素抑菌，进而改善畜禽生产性能的潜能。以上牛津杯抑菌试验结果也与饲用凝结芽孢杆菌对猪鸡生长性能及肠道菌群影响的研究结果一致[3,5,20]。

3.2 凝结芽孢杆菌对肠道主要有益菌的抑制作用 乳酸杆菌是猪鸡等畜禽肠道的主要有益菌，对维持肠道菌群平衡、保障机体健康有重要作用[21]。畜禽肠道中乳酸杆菌的种属很多，其中罗伊氏乳酸杆菌分布最广泛、比例最高[22]。本试验首次对比研究了凝结芽孢杆菌、金霉素和土霉素对罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用，结果显示凝结芽孢杆菌对罗伊氏乳酸杆菌没有抑制作用；而金霉素和土霉素对罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用达到“高敏感”。因此，就畜禽肠道主要有益菌而言，饲用益生菌凝结芽孢杆菌在维持肠道菌群平衡方面的作用效果，显著优于饲用抗生素。动物饲养试验研究也显示，饲粮单一添加适合剂量的凝结芽孢杆菌能够维持或提高肠道乳酸杆菌数量，从而有效替代抗生素改善仔猪和肉鸡生长性能[3,5,23-24]。

3.3 凝结芽孢杆菌对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用 金黄色葡萄球菌是饲料及饲料原料的主要污染有害菌之一，动物摄入污染金黄色葡萄球菌的饲料，肠道及肝脏等组织受到细菌及毒素的损伤，从而严重降低生产性能，增加死亡的概率[25]。本试验中，凝结芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用为“敏感”（DIZ=14.7 mm）。张韵等[11]检测凝结芽孢杆菌（菌株编号BC147）对金黄色葡萄球菌的DIZ 为14.5 mm；姚晓红等[9]和赵钰等[10]的报道也判定凝结芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用为“敏感”。此外，本研究进一步对比了凝结芽孢杆菌与广谱抗生素金霉素、土霉素对金黄色葡萄球菌的抑制效果，结果显示金霉素、土霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用达到“高敏感”，显著高于凝结芽孢杆菌。以上结果表明，从降低畜禽感染金黄色葡萄球菌的危害而言，饲粮添加凝结芽孢杆菌具有一定的作用，但效果弱于金霉素和土霉素。

3.4 凝结芽孢杆菌对商业饲用益生菌的抑制作用 我国农业农村部规范的饲用益生菌有34 种（《饲料添加剂品种目录》，2013），其中以单一菌或复合菌在饲料及养殖生产中应用较为广泛的包括芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌）、乳酸菌（屎肠球菌、粪肠球菌）、酵母菌（产朊假丝酵母、酿酒酵母）等[7]。本试验中，凝结芽孢杆菌对粪肠球菌的抑制作用判定为“不敏感”，与陈桂芳等[26]报道一致；首次发现凝结芽孢杆菌对产朊假丝酵母没有抑制作用。以上结果表明，凝结芽孢杆菌与粪肠球菌、产朊假丝酵母没有拮抗效应。

本研究显示，凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌的抑制作用达到“敏感”水平。姚晓红等[9]用牛津杯法的研究结果显示，3 株凝结芽孢杆菌（菌株编号B4、BFS-2、NJ）对枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用。赵钰等[10]也用牛津杯法评估得出凝结芽孢杆菌（菌株编号LL1103）对枯草芽孢杆菌有抑制作用的结论。随后，Fu 等[12]再次证明凝结芽孢杆菌（菌株编号L1208）对枯草芽孢杆菌有抑制作用。然而，刘全永等[27]报道，其筛选的凝结芽孢杆菌（菌株编号LU-B02）对枯草芽孢杆菌没有抑制作用。笔者推测，以上凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌抑制作用结果出现差异主要有两方面的原因：其一，不同凝结芽孢杆菌菌株的抑菌性能有差异[9]；其二，不同枯草芽孢杆菌的菌株性能差异较大。枯草芽孢杆菌是我国最早、也是当前应用最广泛的饲用益生菌，因此目前饲料与畜牧行业应用的商业饲用枯草芽孢杆菌的菌株繁多，菌株性能差异较大。大量已报道的动物饲养试验也证明，饲用枯草芽孢杆菌在同一类型动物生长性能上的表现差异巨大[3,28]。

本试验首次研究了凝结芽孢杆菌对行业应用较为广泛的饲用益生菌地衣芽孢杆菌、屎肠球菌的抑制作用，结果显示凝结芽孢杆菌对地衣芽孢杆菌、屎肠球菌的抑制作用判定为“敏感”。这表明凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌、屎肠球菌有一定的拮抗效应。进一步分析显示广谱抗菌药物金霉素、土霉素对地衣芽孢杆菌和屎肠球菌的抑制作用达到“高敏感”，其抑制效果显著高于凝结芽孢杆菌。这可能是以往我国商业饲料在普遍含有多种饲用抗生素基础上，再添加地衣芽孢杆菌、屎肠球菌等饲用益生菌，未能进一步提高畜禽生产性能的主要原因之一[6,29-30]。

以上结果提示，凝结芽孢杆菌与粪肠球菌、产朊假丝酵母没有拮抗效应，可在商业饲料及饲料添加剂中复合使用。鉴于凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌有拮抗效应，在商业饲料及饲料添加剂中复合使用需谨慎考虑。

4 结 论

本研究结果显示，凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用达到“高敏感”，对大肠杆菌K88 和K99、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的抑制作用为“敏感”，且对肠道有益菌罗伊氏乳酸杆菌“不敏感”，这从体外抑菌试验角度验证了饲粮添加凝结芽孢杆菌具有抑制畜禽肠道有害菌、维持肠道有益菌、平衡肠道菌群的促生长作用。建议商业复合饲用益生菌要充分考虑凝结芽孢杆菌与其他饲用益生菌菌株之间可能的拮抗效应。

致谢：感谢云南农业大学动物科学技术学院葛长荣教授对文稿所提的宝贵意见。