榆栀止血颗粒治疗子宫出血的HIF-1α/miR-210轴机制研究

支运霞，张丽娟，徐善荣，陈逸嘉

(1.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；2.青岛市即墨区中医医院妇科，山东 青岛 266200；3.上海龙华医院妇科，上海 200000)

子宫异常出血是临床常见的妇科疾病，可导致子宫内膜病变、不孕、子宫肌瘤等，严重危害女性生命健康。子宫出血机制复杂，目前研究发现，子宫内膜血管生成障碍、激素水平异常等可能是导致子宫异常出血的主要原因。研究证实，机体可通过激活低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的转录表达，调控子宫内膜血管生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达，发挥抑制子宫崩解出血和促进子宫内膜修复的作用。微小RNA-210(micro RNA-210，miR-210)与HIF-1α关系密切，且HIF-1α/miR-210轴可调控血管生成，参与激素调节、细胞增殖及凋亡等多种生理过程。探究HIF-1α/miR-210轴在子宫出血过程中的调控作用，对阐明子宫内膜出血的病理机制有一定意义。榆栀止血颗粒原名妇科止血颗粒，具有清热凉血、调经止血的功效，临床上常用于治疗月经过多，文献报道发现其可有效治疗早孕大鼠子宫出血症，但其治疗子宫出血的具体机制还不明确。本研究建立大鼠子宫出血模型，从HIF-1α/miR-210轴探讨其治疗子宫出血的机制，以期为临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 动物 清洁级健康SD大鼠60只，体质量为200～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2018-0002。所有大鼠于屏障环境动物房中进行常规饲养(自然光照，25℃室温，50%～65%相对湿度)。本试验经过伦理委员会批准[批准文号： IACUC-01(20190825)]，对实验动物的处理符合“3R”原则。

1.2 主要试剂及仪器 榆栀止血颗粒(含地榆炭、墨旱莲、炒栀子、绵马贯众、仙鹤草、炒槐花、拳参、大蓟、炒侧柏叶、棕榈炭、牡丹皮、茜草、蒲黄炭、生地黄、白芍、黄芩、当归等，国药准字 Z20130019，每袋10 g)：山东新时代药业有限公司；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(货号 LMO105)：上海联迈生物工程有限公司；米非司酮(货号 10412)：北京凯瑞基生物科技有限公司；米索前列醇片(货号 RK170327)：深圳市洛克生化科技有限公司；雌二醇(serum estradiol，E)(货号 YE01847)、孕酮(progesterone，P)(货号 YE01938)等酶联免疫试剂盒：上海远慕生物科技有限公司；HIF-1α抗体(货号 ab228649)、VEGF抗体(货号 ab32152)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)抗体(货号 ab134184)：美国abcam公司。光学显微镜(货号 SMZ745)：日本尼康公司；蛋白电泳仪(货号 1659001)：美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪(货号 GIS-500)：杭州米欧仪器有限公司等。

2 方法

2.1 大鼠子宫出血模型复制及分组给药 参照文献[11]的方法建立大鼠妊娠模型，并于妊娠第7天8：00和18：00分别灌服米非司酮(13.8 mg/kg)和米索前列醇(135 μg/kg)复制子宫出血模型，阴道置入棉球，次日取出棉球观察，若棉球上有血，表明模型复制成功。将模型复制成功的50只大鼠，按随机数字表法分为模型组，榆栀止血颗粒低剂量(4 g/kg)、中剂量(8 g/kg)、高剂量(16 g/kg)组，阳性对照(宫血宁0.07 g/kg)组，每组10只，另取正常妊娠大鼠10只，于相同时间灌胃给予等量生理盐水，作为正常组。各组大鼠均于模型复制成功后(妊娠第8天)开始给药，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及阳性对照组参照文献[11-12]设置剂量，并用生理盐水稀释成0.4、0.8、1.6、0.007 g/mL的混悬液，按10 mL/kg的剂量灌胃给药；正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，各组连续给药7 d，每日1次。

2.2 大鼠阴道出血量测定 参照文献[11]的方法在给药期间于阴道内置入质量为75～80 mg棉球一个，次日分别于8：00和18：00将棉球取出，置换一个新棉球，观察阴道出血情况，收集出血棉球置于烧杯内，记录并加适量50 g/L NaOH浸泡、挤压、搓洗棉球血渍并过滤，取4 mL滤液，作为试验管。用血红蛋白吸管吸取大鼠尾静脉血0.02 mL，加入等浓度NaOH溶液4 mL，混匀，作为空白对照管。取空白管和对照管于546 nm波长下记录吸光度(

A

)值，根据公式计算子宫出血量。子宫出血量=0.02×浸提液

A

值×所用NaOH总容积/(4×空白管

A

值)。

2.3 大鼠血液指标检测及子宫组织标本采集 麻醉大鼠，取颈总动脉血6 mL(不加抗凝剂)，以3 000 r/min离心10 min，取上层血小板血浆用半自动凝血分析仪按照凝血四项说明书测定凝血酶时间(thrombin time，TT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)。另取全血2 mL，静置30 min后以 3 000 r/min 离心10 min，取上清液按ELISA试剂盒说明书检测血清E、P含量。处死大鼠，取子宫内膜组织，剪取部分置于-80 ℃冰箱保存；剩余组织迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h备用。

2.4 HE染色法观察子宫组织形态变化 取“2.3”中4%甲醛中固定的组织标本，常规处理切片(厚5 μm)。按HE试剂盒说明书进行染色后，于显微镜下观察组织形态变化。

2.5 qRT-PCR检测子宫内膜组织HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA相对表达水平 取“2.3”中冰冻组织标本，4 ℃解冻后，冰上匀浆、离心分离，取上清液，用Trizol试剂盒抽提总RNA，按逆转录试剂盒说明书以总RNA为模板，逆转录cDNA，并按反转录试剂盒说明书步骤进行扩增，共进行36个循环，严格按试剂盒说明建立反应体系及参数，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物设计见表1。HIF-1α mRNA及VEGF mRNA以β-actin为内参基因，miR-210以U6为内参基因，采用2-ΔΔ算法计算HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 Western blot法检测子宫内膜组织中HIF-1α、VEGF、MMP-2蛋白相对表达水平 取子宫内膜组织匀浆液，蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法检测蛋白总浓度，取50 μg蛋白上样，行电泳和转膜反应，加入一抗[HIF-1α、VEGF、MMP-1(1∶1 000)、β-actin(内参，1∶2 000)]抗体，4 ℃摇床孵育过夜，加入HRP羊抗兔二抗(1∶2 000)，37 ℃摇床孵育1 h，用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以Image J软件分析各组蛋白相对表达情况。

3 结果

3.1 各组大鼠阴道出血量及血清E、P水平比较 与正常组比较，模型组大鼠阴道出血量增加，血清E、P水平均降低(

P

<0

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05)。与模型组比较，榆栀止血颗粒各剂量组大鼠出血量减少，E、P水平升高(

P

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05)，且呈剂量依赖性；榆栀止血颗粒高剂量组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(

P

>0

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05)。见表2。

表2 各组大鼠阴道出血量及血清E2、P水平比较

3.2 各组大鼠TT、PT、APTT比较 与正常组比较，模型组大鼠TT、PT、APTT增加(

P

<0

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05)。与模型组比较，榆栀止血颗粒各剂量组大鼠TT、PT、APTT减少(

P

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05)，且呈剂量依赖性；榆栀止血颗粒高剂量组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(

P

>0

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05)。见表3。

表3 各组大鼠TT、PT、APTT比较

3.3 各组大鼠子宫内膜组织形态学观察 正常组大鼠子宫组织结构正常，上皮细胞单层整齐排列在子宫内膜基底部，梭形细胞在固有层下面分散排列，偶见毛细血管，无炎症细胞浸润；模型组大鼠子宫内膜固有层间质细胞增生，细胞形态破坏，上皮细胞排列散乱无序，血管扩张、间质纤维化及炎症细胞浸润明显。榆栀止血颗粒低、中剂量组大鼠子宫内膜固有层细胞中度增生，炎症细胞浸润减轻；榆栀止血颗粒高剂量组和阳性对照组固有层轻度增生，炎症浸润进一步减轻。见图1。

3.4 各组大鼠子宫内膜组织HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠子宫内膜组织HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表达水平明显下降(

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<0

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05)。与模型组比较，榆栀止血颗粒各剂量组大鼠HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表达水平明显上升(

P

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05)，且呈剂量依赖性；榆栀止血颗粒高剂量组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(

P

>0

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05)。见表4。

表4 各组大鼠子宫内膜组织HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表达水平比较

3.5 各组大鼠子宫内膜组织HIF-1α、VEGF、MMP-2蛋白表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠子宫内膜组织HIF-1α、VEGF蛋白表达水平降低(

P

<0

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05)，MMP-2蛋白表达水平升高(

P

<0

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05)。与模型组比较，榆栀止血颗粒各剂量组大鼠HIF-1α、VEGF表达水平均升高(

P

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05)，MMP-2蛋白表达水平降低(

P

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05)，且呈剂量依赖性；榆栀止血颗粒高剂量组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(

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>0

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05)。见图2、表5。

表5 各组大鼠子宫内膜组织HIF-1α、VEGF、MMP-2蛋白表达水平比较

注：A.正常组；B.模型组；C.榆栀止血颗粒低剂量组；D.榆栀止血颗粒中剂量组；E.榆栀止血颗粒高剂量组；F.阳性对照组

注：A.正常组；B.模型组；C.榆栀止血颗粒低剂量组；D.榆栀止血颗粒中剂量组；E.榆栀止血颗粒高剂量组；F.阳性对照组

4 讨论

子宫及宫颈炎症病变、子宫内膜增生、全身凝血障碍等均可导致子宫异常出血。药物治疗、刮宫术及手术切除术是针对出血的治疗策略，但这些策略治疗效果不显著，且对子宫及人体伤害较大。榆栀止血颗粒原名妇科止血颗粒，方中诸药相互配伍，可入冲任而凉血、调经、止血。尹艳艳等发现，妇科止血颗粒可降低早孕大鼠阴道出血量，并促进子宫内膜修复。本研究建立大鼠子宫出血模型，并采用榆栀止血颗粒进行治疗，结果发现，榆栀止血颗粒可缓解大鼠子宫内膜固有层间质增生及炎症细胞浸润等病理损伤，并能呈剂量依赖性降低大鼠子宫出血量，提高凝血功能，升高激素水平，且高剂量组作用效果与阳性对照组相似。

VEGF及MMPs是参与血管生成、促进子宫内膜伤口愈合、终止出血的重要因子。黄琪等发现黄芩炭可通过升高VEGF和降低MMP-2的表达水平来促进子宫内膜血管生成，降低早孕大鼠子宫出血量。另外，VEGF又受HIF-1α调控，且HIF-1α-VEGF通路是调控子宫内膜崩解出血及修复的重要通路。Maybin等发现HIF-1α表达水平降低，可导致月经严重出血患者子宫内膜修复延迟。Chen等发现HIF-1α mRNA表达水平增高，能直接调节下游VEGF表达，抑制子宫内膜脱落及出血。本研究发现，模型组大鼠HIF-1α/VEGF轴基因及蛋白表达水平降低，而榆栀止血颗粒随剂量升高，HIF-1α/VEGF轴蛋白表达水平也显著升高，且高剂量组作用效果与阳性对照组相似，提示榆栀止血颗粒抑制大鼠子宫出血及损伤的作用机制可能与激活HIF-1α/VEGF通路有关。

HIF-1α与miR210有结合位点。Bakirtzi等发现HIF-1α表达水平降低的同时，也可引起miR210表达水平的降低，而过表达HIF-1α可通过提高miR210表达水平，来促进小鼠结肠组织血管生成。本研究发现，榆栀止血颗粒随剂量升高，miR210及HIF-1α表达水平也显著升高，且高剂量组作用效果与阳性对照组相似，推测榆栀止血颗粒减少子宫出血的作用机制可能与激活HIF-1α/miR210轴有关。

综上所述，榆栀止血颗粒可激活HIF-1α/miR210轴，促进子宫内膜血管生成和修复，抑制子宫出血，为阐明子宫出血机制提供了参考。但HIF-1α/miR210通路促进血管生成的机制十分复杂，且中药治疗疾病具有多靶点、多途径的作用，榆栀止血颗粒还可能通过其他途径抑制子宫出血，这有待后续深入研究。