光敏剂5-氨基酮戊酸联合阿霉素对乳腺癌荷瘤裸鼠光动力作用及其机制的研究

祝寅 陈苏杰

1江苏省句容市人民医院血液肿瘤科 212400；2江苏省句容市人民医院CT室 212400

乳腺癌是目前诊断最常见的癌症，也是女性最致命的疾病之一［1］。乳腺癌的常规治疗包括手术、放射、化疗和糖皮质激素治疗。然而，并不是所有乳腺癌患者都推荐手术治疗，并且传统的化疗有多种不良反应，包括耐药细胞的出现和毒性反应。因此，人们正在研究新的治疗方法。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是一种新兴的治疗方式，早期PDT的研究中，发现局部乳腺癌是PDT的第一个靶点，随后PDT 在胸壁转移患者的研究中被证明有效［2-3］。光敏剂5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）已被成功用于诊断和治疗肿瘤。与其他类型的光敏剂相比，5-ALA 具有更高的肿瘤特异性和更少的光毒性［4］。PDT 常常与常规化疗相结合［5］，通过纳米技术形成多模式协同治疗平台。

本研究针对目前女性高发、病死率高的的乳腺癌，采用随机对照实验以裸鼠乳腺癌移植瘤为模型开展研究，使用5-ALA 联合阿霉素（doxorubicin，DOX）进行治疗，并对其作用机制进行初步探索，以期为临床应用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 资 料 2020 年10 月，选 取6 周 龄SPF 级 雌 性BALB/c-nu/nu 裸鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证编号：SCXK（京）2019-0009］，体质量（20±2）g。5-ALA 和DOX 购 自 美 国Sigma-Aldrich（纯 度 为HPLC≥98.0%），一抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α， HIF-1α） 、 3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗购自美国Cell Signaling。胎牛血清和RPMI-1640 细胞培养液购自南京生航生物技术有限公司。4T1 小鼠乳腺癌细胞购自宁波明舟生物科技有限公司。RIPA 裂解缓冲液、BCA 蛋白测定试剂盒、苏木素伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒购自上海碧云天生物。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌小鼠模型的建立 BALB/c-nu/nu 裸鼠饲养在SPF 级实验动物室的IVC 系统内，昼夜循环饲养12 h，温度（20±2）℃，相对湿度（60±5）%。动物实验按照动物研究伦理协议进行，在诱发乳腺癌之前，实验小鼠经历了1 周的新环境适应期。用含10%胎牛血清、链霉素（100 U/ml）和青霉素（100 U/ml）的RPMI-1640 培养基在37 ℃的CO2的培养箱中培养4T1 细胞，收集培养的细胞，悬浮于PBS 中，将含2×105个细胞0.2 ml 混合物注射到裸鼠背部皮下。注射后，监测小鼠潜在的肿瘤发展，并使用数字卡尺测量肿瘤的大小。当肿瘤长至约9 mm时，再将其分成4组。

1.2.2 动物分组及治疗 将32 只荷瘤裸鼠分为4 组（每组8 只）：A 为空白对照组（不给任何治疗）；B 为DOX 组（2 mg/kg DOX，每周1 次，共3 次）；C 为PDT 组（50 mg/kg 5-ALA+660 nm 激光照射，总照射剂量200 J/cm2，同时避光24 h，每周1 次，共3 次）；D 为联合治疗组（2 mg/kg DOX+50 mg/kg 5-ALA+660nm 激光照射）。化疗药物注射12 h后，腹腔注射5-ALA，12 h后进行激光照射，能量密度为200 J/cm2，照射时间为20 min。至治疗后的第21 天，采用颈椎脱臼法处死裸鼠，肿瘤标本取出后先称瘤重并计算抑瘤率，公式为：（1－治疗组平均瘤重）/荷瘤组平均瘤重×100%，将一部分肿瘤组织置于福尔马林液中固定以备免疫组化染色。在治疗过程中，第一次治疗前及治疗后隔天测量所有裸鼠瘤径。按照文献方法 计 算 裸 鼠 瘤 体 积：V（cm3）=d2（cm2）×D（cm）/2［6］，其中d和D依次表示肿瘤的最短和最长径。

1.3 肿瘤组织形态学观察 肿瘤标本在4%多聚甲醛溶液中固定至少24 h 后，石蜡包埋，4 µm 厚切片，脱蜡后HE染色，光镜下观察。

1.4 Western blotting 检测 用RIPA 裂解缓冲液提取肿瘤组织总蛋白，用BCA 检测试剂盒测定总蛋白浓度。总蛋白（100 µg）经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF 膜上。经5%脱脂牛奶封闭后，将膜与特异性一抗EGFR、HIF-1α 和GAPDH 在4 ℃下孵育过夜。随后，将样品与HRP 偶联的二抗进行孵育，采用ECL 检测系统进行灰度值分析。

1.5 统计学处理 所有实验数据采用SPSS 22.0 进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以(±s)表示，采用方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时使用Tamhane's 法，其中P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-ALA 联合DOX 对乳腺癌荷瘤裸鼠体质量的影响 PDT 组 体 质 量 为（21.25±1.55）g，空 白 对 照 组 为（20.32±1.34）g、DOX 组为（18.16±1.10）g、联合治疗组为（17.93±1.21）g，DOX 组、联合治疗组分别与空白对照组及PDT 组相比，体质量均显著下降（t=2.087、2.986、3.014、4.212，均P＜0.05），而PDT 组与空白对照组、DOX 组与联合治疗组的体质量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 5-ALA 联合DOX 对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤体积及抑瘤率的影响 PDT 组肿瘤体积为（0.71±0.13）cm3、DOX 组为（0.65±0.19）cm3、空白对照组为（0.98±0.21）cm3，PDT 组、DOX 组分别与空白对照组比较，肿瘤体积均明显缩小（t=5.729、4.388，均P＜0.05）；而联合治疗组肿瘤体积为（0.41±0.13）cm3，在所有组中最小，与其他组相比，差异均有统计学意义（t=10.884、8.769、6.182，均P＜0.05）。联合治疗组抑瘤率（58.20%，1.10/1.89）显著高于PDT 组（27.51%，0.52/1.89）和DOX 组（33.86%，0.64/1.89）（t=8.521、8.867，均P＜0.05）。

2.3 5-ALA 联合DOX 对乳腺癌荷瘤裸鼠病理结果的影响 HE 染色显示空白对照组肿瘤细胞致密，结构完整。其余各组细胞凋亡和坏死明显增多，凋亡细胞缩小，胞浆浓缩，其中联合治疗组细胞凋亡和坏死最严重。

2.4 5-ALA 联合DOX 对乳腺癌荷瘤裸鼠EGFR 和HIF-1α 蛋白表达的影响 研究结果表明，PDT 组和联合治疗组与空白对照组和DOX 组相比，EGFR 和HIF-1α 蛋白表达均显著下降（t=2.354、3.287、4.239、5.894，均P＜0.05）。见图1。

图1 5-ALA联合DOX对乳腺癌荷瘤裸鼠EGFR（A）和HIF-1α（B）蛋白表达的影响

3 讨 论

现有的乳腺癌临床治疗方法不良反应大、预后差，迫切需要新的有效治疗乳腺癌的方法。PDT 是一种很有前途的微创治疗方法，自20世纪90年代以来被广泛应用于各种肿瘤的治疗［7］。PDT 与传统放疗或化疗的优势变得越来越明显，包括部位特异性、克服肿瘤对其他疗法的耐药性及不良反应很少。本研究结果也显示，PDT 组与空白对照组相比，体质量差异无统计学意义，虽然联合治疗组与空白对照组、PDT相比，体质量均显著下降，但其与DOX组之间的体质量比较差异无统计学意义，表明了PDT 治疗具有不良反应小的优点。

PDT 的治疗优势在于它能够靶向乳腺肿瘤，并将对其他正常组织的损害降至最低，它还与化疗有协同抗癌作用。本研究显示联合治疗组小鼠的肿瘤体积最小、抑瘤率最高，且病理结果发现联合治疗组与其他组相比，细胞凋亡和坏死最严重，表明PDT联合化疗治疗乳腺癌具有较好的疗效，两者联用具有协同增效的作用。

EGFR是一种酪氨酸激酶受体，在许多类型的实体肿瘤中被认为是癌基因，30%的乳腺癌过度表达EGFR，这种过度表达与不良预后相关［8］。而缺氧或低氧浓度是导致肿瘤进展的另一个因素，HIF-1α 激活血管生成［9］，并抑制凋亡［10］。因此，缺氧肿瘤往往与不良的预后相关。本研究发现PDT可以抑制肿瘤组织EGFR和HIF-1α蛋白的表达。

综上所述，本研究发现PDT 联合DOX 治疗乳腺癌具有疗效好、不良反应小的优点，机制可能与PDT 抑制EGFR 和HIF-1α蛋白表达有关。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。