内毒素血症对大鼠肾功能及肾素-血管紧张素系统的影响分析

李晶铃阴赪宏

(1.清华大学医院内科，北京 100086；2.北京妇产医院，北京 100026)

多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是严重感染、创伤、大手术等原发病发生后，机体同时或序贯发生两个及以上器官或系统功能障碍的临床综合征，病情凶险，病死率高，是ICU首位致死原因[1－2]。在MODS的病理进程中，各个器官和系统的损伤具有一定的规律性，其中肾首当其冲，往往先于其他器官出现功能异常[3－5]，而心血管和神经系统则通常为疾病的终末期表现。作为体内最大的代谢器官，肝是清除内毒素的主要工作站，也是内毒素攻击的首要对象之一[6－7]。肾素-血管紧张素系统(RAS)广泛存在于心、肝、肾、脑、肺等机体主器官中，前期研究发现，在这些器官受到损伤时，肾素-血管紧张素系统(RAS)会激活，表现为血管紧张素转换酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其受体AT1R、AT2R表达升高。本研究重点分析内毒素血症大鼠疾病发展的不同阶段，肾功能以及肾中RAS的变化。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康清洁级(SPF)雄性Wistar大鼠90只，6~8周龄，体重250~270 g，购自中国医学科学院实验动物中心[SCXK(京)2017-003]，饲养于友谊医院动物实验室[SYXK(京)2018-0025]，本研究严格遵守3R原则，获得了友谊医院动物实验管理与动物福利伦理委员会的伦理审批(CMU2016080135)。

1.2 主要试剂与仪器

NO化学法试剂盒(批号201912046)、内皮素(ET，批号202006157)、一氧化氮合酶(NOS，批号202006151)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；血管紧张素转换酶(ACE，批号20200715)试剂盒购自海军总医院；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ，批号20200314)试剂盒购自北京市福瑞生物工程公司；AT1R、AT2R及内参引物(批号M12046，M12052)购自美国Santa Cruz公司；脂多糖(LPS，批号20200715)购自德国Sigma公司。智能放免测量仪(SN-6958型，上海原子能研究所日环仪器厂)；内毒素测定仪(BET-72型，上海精密仪器仪表有限公司)；小型垂直电泳与电转印装置(美国Bio-Rad公司)；高速低温离心机(3K-18型，德国Sigma公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备与取样方法

所有大鼠，适应性饲养1周，剔除体重过小或过大者，剩余90只。剩余大鼠随机分为2组，对照组10只和模型组80只，模型组腹腔注射10 mg/kg LPS，对照组注射等体积无热源水。分别于注射2、4、8、12、24、48、72、168 h随机选取10只，1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，取心脏血，室温静置2 h，离心取血清，离心重力2184 r/min，－20℃存储，备用。之后摘取肺、肾、肝及心脏，生理盐水冲洗干净血液，分两份，一份放入4%多聚甲醛液中固定备用，一份放入冷冻管中，于液氮中保存备用。

1.3.2 血清学指标检测

采用内毒素测定仪测定内毒素水平；采用硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)水平；智能放射免疫测量仪和ELISA试剂盒测定内皮素(ET)、RAS标志物管紧张素转换酶(ACEⅡ)、肾素(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平，比色法测定一氧化氮合酶(NOS)水平，全自动生化仪测定肾功能指标血肌酐、尿素氮水平。

1.3.3 HE染色实验观察肾病理后特征

取对照组和模型组LPS注射24 h的多聚甲醛固定的肾组织，采用常规石蜡包埋的方法制备病理切片，切片厚度5~7μm，留作HE染色实验，1周内检测。主要步骤:二甲苯脱蜡，即将病理切片浸泡于二甲苯中10 min，反复操作两次。梯度乙醇水化，依次采用无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水浸泡1~3 min。苏木素染色10 min，流水冲洗干净染液，加入1%的盐酸乙醇分化3 s，流水冲洗，返蓝染色液返蓝。苏木素复染后，梯度乙醇脱水，75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇依次浸泡3~5 min，无水乙醇浸泡2次，每次10 min。二甲苯透明，中性树胶封片，电子显微镜下观察肾小管和肾小球结构。

1.3.4 免疫蛋白印迹实验(Western blot)检测肾组织AT1R和AT2R的蛋白表达

液氮保存的肾组织，冰上自然解冻，采用蛋白质提取试剂盒提取蛋白质，BCA法定量蛋白浓度，并采用5×buffer缓冲液配置为1μg/μL的溶液，采用Western blot测定RAS标志物AT1R和AT2R的表达水平。组装Western blot的电泳槽，配置浓缩胶、分离胶和电泳液，预备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在点样前，先以40 V电泳30 min，以排除胶体内的杂志，然后点样，每孔点样10μL，60 V电泳30 min通过浓缩胶，80 V电泳60 min通过分离胶。经电泳后，蛋白质按照分子量大小自分离胶中分离开来，形成蛋白条带，将此条带转印至羟甲基纤维素(NC)膜，转印条件，80 V×60 min。转印成功后，将NC膜封入5%的脱脂牛奶，37℃震荡摇匀90 min，封闭非特异性条带。PBST液清洗3次，每次5 min，一抗孵育，AT1R、AT2R的一抗浓度均为1∶2000，内参GAPDH的浓度为1∶2500，4℃震荡摇匀过夜。PBST液清洗3次，每次5 min，二抗孵育，浓度均为1∶2500，37℃震荡摇匀60 min。滴加ECL发光液，暗室显影。采用影像分析软件Image J分析灰度值，目的蛋白表达量＝目的条带灰度值/内参条带灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析数据，本组均为计量资料，符合正态分布，方差齐，以平均数±标准差(±s)表示，方差分析有统计学差异者进一步采用LSD-t检验分析两组间差异。P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 内毒素和氧化应激标志物

模型组大鼠循环LPS在注射后迅速升高，2 h达峰，168 h降至正常水平，中间时间段均高于对照组(P<0.05)。内皮素、NO与NOS在注射后逐渐升高，12 h达峰，NO在4~48 h高于对照组，内皮素和NOS在2~48 h高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠内毒素和氧化应激标志物水平变化Figure 1 Level changes of endotoxin and oxidative stress biomarkers between groups

2.2 肾病理

对照组大鼠的肾小管排列整齐，基本无炎性细胞浸润；肾小球形态完整，基底膜清晰。模型组大鼠肾小管结构萎缩，排列紊乱，可见大量红色的炎性细胞浸润；肾小球体积增大，基底膜不清，可见弥漫性系膜增生和红色的炎性细胞浸润，偶见新月体形成。见图2。

图2 对照组与模型组大鼠肾病理特征比较Figure 2 Comparison of renal pathological features between control group and model group

2.3 肾脏指数和肾功能

模型组大鼠肾脏系数在LPS注射后逐渐升高，在8~12 h达峰，在2~168 h高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组血肌酐和尿素氮在LPS注射后逐渐升高，在8~12 h达峰，2~168 h之间的水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠肾系数和肾功能指标水平变化Figure 3 Level changes of renal coefficient and renal function index between groups

2.4 血清RAS标志物

模型组大鼠循环PRA在注射后迅速升高，2 h达峰，48 h降至正常水平，中间时间段均高于对照组(P<0.05)。ACE和AngⅡ在注射后逐渐升高，8 h达峰，ACE在2~24 h高于对照组，AngⅡ在2~48 h高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠血清RAS标志物水平变化Figure 4 Changes of serum RASmarkers of rats between groups

2.5 肾组织AT1R和AT2R的表达

对照组大鼠各个时间点肾AT1R和AT2R表达水平较为一致，无明显波动。模型组大鼠AT1R和AT2R在LPS注射后逐渐升高，肾组织AT1R和AT2R在8 h达到高峰，2~168 h之间的水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 各组大鼠肾AT1R和AT2R的表达变化Figure 5 Changes of AT1R and AT2R expression in the kidneys between groups

3 讨论

RAS是人体内重要的体液调节系统，对人体的免疫、内分泌和代谢功能均有调节作用，在循环系统中的作用报道较多，其主要活性分子AngⅡ广泛分布于血管平滑肌细胞，可促进血管内皮细胞增殖、血管收缩和局部炎性反应[8]。国内学者孙天孚[9]检测颅内动脉瘤患者血液、脑脊液、动脉瘤壁上的RAS相关蛋白ACE、AngⅡ、AT1R的表达水平，证实颅内动脉瘤循环和脑组织的RAS均被激活，且其相关蛋白的表达水平与炎性因子呈正相关性。在脑梗死、慢性肾病及高血压疾病中，也有循环RAS被激活的相关报道[10]。随着病理研究的深入进展，研究者们发现RAS广泛分布于机体的各个器官，并参与了各种原因导致的器官损伤，其中肾、心脏和脑最先受到重视。现有研究已证实高血压所致肾损伤、原发性肾、糖尿病肾病及免疫相关肾病中均存在RAS过度激活[11－12]，RAS抑制剂和拮抗剂也已用于临床，在改善高血压所致肾功能损伤方面取得了积极作用[13－14]。学者Yang等[15]对比分析了119例合并心血管病变患者和241例无心血管病变患者的血液透析资料，发现合并心血管病者循环ACE/ACE2比值明显升高，暗示着心血管系统病变可加重全身RAS功能异常。后有学者指出心脏内部存在局部RAS，其功能变化可预测慢性心力衰竭患者的预后[16]。

内毒素血症是一种以MODS为主要病理表现的危重病，发病过程累及多个器官与系统，本研究重点考察肾中RAS的变化。研究采用直接注射内毒素LPS的方式制备内毒素血症大鼠模型，注射后，大鼠循环系统内毒素水平可在LPS注射后2 h即可达到峰值，并持续保持在一个较高的水平，这与其他学者的既往报道结果基本一致。随后内皮素和氧化应激标志物NO、NOS水平也相继升高，在12 h达到高峰。氧化应激损伤以及内皮功能异常是内毒素血症引发血管和器官损害的重要机制，这几项指标跟随内毒素波动而波动是内毒素血症模型制备成功的侧面反映。

本研究发现在注射LPS以后肾脏系数、血肌酐和尿胆素逐渐升高，肾功能各个指标达到峰值的时间相差不大，均为8~12 h，说明肾功能也受到了较大损害。大鼠血清ACEⅡ、PRA、AngⅡ也在LPS注射后12 h内达到峰值，这说明RAS的发生与内毒素血症所致的肾与肝损伤可能是同时发生的。为分析内毒素血症发病过程中肾RAS的变化，本研究对肾组织的AT1R和AT2R表达水平也做了检测。AT1R和AT2R是AngⅡ的重要受体，AngⅡ为RAS的两大主要活性分子之一，这一分子主要通过与其受体AT1R和AT2R结合而发挥作用。研究表明，AT1R被激活可诱导炎性反应、细胞外基质合成和细胞增殖，参与炎性浸润、氧化应激损伤、组织器官纤维化损伤、肿瘤微血管生成和肿瘤细胞迁移等病理行为[17－18]。AT2R被激活可调节血管压力、内分泌与代谢功能[19－20]。在内毒素血症中，AT1R和AT2R共同参与了器官损伤机制。本研究结果显示，肾组织的AT1R和AT2R表达变化在LPS注射后8 h达到高峰，说明内毒素血症所致肾损伤中可能有RAS的参与。

综上所述，本研究分析了内毒素血症大鼠模型发病的不同时间点肾损伤及局部RAS的变化，发现肾损伤过程中伴随着组织AT1R和AT2R的表达异常，认为内毒素血症所致肾损伤中可能有RAS的参与。