阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠超声心功能指标与核因子κB p65表达水平关系

李 新，白 雪，李 娜

(1.铜川市人民医院超声医学科， 陕西 铜川 727000；2.安康市中心医院超声科，陕西 安康725000； 3.西安交通大学第一附属医院检验科，陕西 西安 710061)

心脏损伤在临床上比较常见，多指心肌损害后继发的心脏大小、结构、形状的任何改变，病理特征表现为病理性心肌细胞肥大、心肌细胞外基质过度沉积[1-2]。除了外伤导致外，心脏损伤发生的机制复杂，涉及到诸多信号途径的参与。核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65为一个转录因子蛋白家族，可对氧化应激反应产生极强的敏感性，NF-κB p65表达升高可促使机体产生大量细胞因子，诱发内质网应激反应，从而调节心肌细胞凋亡[3-4]。有研究显示NF-κB p65可借助基因表达产生如血管舒张等作用，参与了慢性心力衰竭的病理生理过程[5]。阿霉素属蒽环类抗生素，阿霉素能引起氧自由基的形成，对肿瘤细胞的核或核膜产生直接攻击，从而广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗中[6]。但是阿霉素在抗肿瘤的同时对正常的组织器官也有一定的毒性作用，在一定程度上可产生心肌毒性作用，且与剂量高度相关，可使得机体出现心脏增大、心功能降低、心肌间质纤维化等表现[7]。超声心动图是临床上常用的检查机体心功能的重要方法之一，具有直观、准确、实时与无创等优点，特别是高频超声更加具有高分辨率、低穿透性等优点，从而能有效评价心脏的收缩与舒张功能[8-9]。本文具体探讨了阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠的超声心功能指标与NF-κB p65表达水平的关系，以明确超声应用的价值与心脏损伤发生的机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究材料 清洁级雄性健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠72只购自江苏菱菲生物科技公司，体重220～250 g，由本院实验动物中心饲养，许可证号：SCXK2984821。大鼠分笼饲养，每笼5只左右，自由饮水，自由食用饲料，动物房温度与湿度保持在25 ℃与50%左右。阿霉素(盐酸阿霉素)购自深圳万乐药业有限公司，抗NF-κB p65抗体购自bioworld公司，抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自博士德公司，丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒购自南京建成生物有限公司，3%戊巴比妥钠溶液安徽购自上海生工公司。超声诊断仪购自Philips公司(IE33)，探头频率12 MHz，配偶图像采集工作站。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠分组与建模：将大鼠随机平分为三组：对照组、模型A组、模型B组，三组分别给予腹腔注射0、1、5 ml/kg阿霉素，每周3次，连续2周。

1.2.2 观察指标：在造模第1周与第2周每组各处死12只大鼠，进行以下指标的检测与记录。①大鼠麻醉后取左侧卧位，超声设置探查角度为15°～30°，深度为2～3 cm，经右颈总动脉逆行插入左心室，记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室射血分数(LVEF)与左室短轴缩短率(LVFS)等指标。②摘取大鼠的心脏，心脏剪成1 mm3大小碎块，1 g/L胰酶和0.3 g/L胶原酶进行消化，1000 r/min下4 ℃离心5 min，取上清，检测MDA含量及SOD活性。③取心脏的心肌组织，置10%中性甲醛缓冲液固定，制成病理切片后进行常规苏木精伊红染色，镜下观察心肌组织形态学改变。④取心脏的心肌组织，用细胞裂解液裂解得到蛋白，根据15 μg与15 μl体积进行上样，进行蛋白杂交分析，一抗为稀释后的NF-κB p65(1∶1000)，β-actin(1∶2000)，曝光后用Image软件半定量分析条带灰度，相对表达量以各样本与β-actin条带灰度比值计算。

2 结 果

2.1 三组造模后不同时间点心脏参数比较 模型A组、模型B组造模第1周与第2周的LVSP与LVEDP值高于对照组(均P<0.05)，LVEF与LVFS值低于对照组(均P<0.05)，模型A组与模型B组对比差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组造模后不同时间点心脏参数比较

2.2 三组造模后不同时间点MDA含量及SOD活性比较 模型A组、模型B组造模第1周与第2周的SOD活性低于对照组(均P<0.05)，MDA含量高于对照组(P<0.05)，模型A组与模型B组对比差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 三组造模后不同时间点MDA含量及SOD活性比较

2.3 三组心肌HE染色情况对比 模型A组、模型B组：心肌呈典型心肌病样改变，伴有炎性细胞浸润，肌纤维扭曲肿胀，胞外间隙增宽。对照组：心肌纤维排列整齐，细胞间隙正常。

2.4 三组造模后不同时间点心肌组织NF-κB p65蛋白相对表达水平比较 模型A组、模型B组造模第1周与第2周的NF-κB p65蛋白相对表达水平低于对照组(均P<0.05)，模型B组低于模型A组(P<0.05)。见表3。

表3 三组造模后不同时间点心肌组织NF-κB p65蛋白相对表达水平比较

2.5 阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠超声心功能指标与NF-κB p65表达水平相关性分析 在模型B组中，造模第2周的NF-κB p65蛋白相对表达水平与LVSP、LVEDP、LVEF、LVFS都存在相关性(均P<0.05)。见表4。

表4 阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠超声心功能指标与NF-κB p65表达水平相关性分析

3 讨 论

阿霉素是一种广谱抗肿瘤抗生素，具有较强的剂量依赖性心脏毒性，可导致相关心肌病，能够成功诱导出大鼠心脏损伤模型。同时阿霉素的诱变性和心脏毒性部分相关，为此应用抗氧化剂可以减轻阿霉素对心肌的损伤[10]。随着基础研究的深入，超声心动图已广泛应用于评定机体的心肌缺血、心肌梗死时局部及整体心功能变化情况，具有价廉、无创、实时等优点。特别是当前高频超声具有更高的时间分辨力，通过调节扫描角度、取样深度从而获得不同心肌节段整个心动周期的运动信息，从而更全面地评价心脏状况[11-12]。本研究显示模型A组、模型B组造模第1周与第2周的LVSP与LVEDP值高于对照组(均P<0.05)，LVEF与LVFS值低于对照组(均P<0.05)，模型A组与模型B组对比差异也都有统计学意义(P<0.05)，表明阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠成功。目前认为阿霉素的心脏毒性与其抗肿瘤活性无关，主要与氧自由基损伤、钙超载等因素存在相关性，抗氧化剂可减轻阿霉素的心脏毒性作用[13]。本研究显示模型A组、模型B组造模第1周与第2周的SOD活性低于对照组(均P<0.05)，MDA含量高于对照组(P<0.05)，模型A组与模型B组对比差异也都有统计学意义(P<0.05)。从机制上分析，含量高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，也是膜脂质过氧化重的要产物[14]。SOD是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶，也可反映机体内源性清除超氧阴离子及过氧化氢的能力[15]。阿霉素对心脏的急性毒性作用主要表现为心肌炎、扩张性心肌病、充血性心力衰竭、心律失常等，阿霉素可导致大鼠心肌氧化损伤，从而使得SOD活性降低与MDA含量增加[16]。

NF-κB p65是氧化应激的重要调节器，在机体通过刺激炎症和氧化应激在介导血管内皮功能障碍的发生与发展。抑制NF-κB p65的表达可能会限制炎症和氧化应激的恶性循环，也是预防动脉老化的重要靶基因[17]。下调NF-κB p65的表达能够通过调控炎症、凋亡、纤维化等，参与心血管疾病的发生发展。本研究显示模型A组、模型B组造模第1周与第2周的NF-κB p65蛋白相对表达水平低于对照组(均P<0.05)，模型B组低于模型A组(P<0.05)，表明阿霉素诱导心脏损伤模型可导致NF-κB p65蛋白相对表达水平增加。当前也有研究表明抑制NF-κB p65表达可缓解机体的氧化应激作用，减少血管内皮细胞硝基酪氨酸和NADPH氧化酶表达，减轻对血管内皮的损伤作用[18-19]。

本研究采用的高频超声探头具有穿透力弱、分辨力高等特点，能获得大鼠清晰的左室长轴切面及心尖四腔心切面图像，从而可准确评价大鼠心脏的收缩与舒张功能[20-21]。本研究显示阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠的超声心功能指标与NF-κB p65表达水平存在相关性(P<0.05)。从机制上分析，阿霉素在体内还原为半醌，与心肌的亲和力高，发生氧化反应后生成自由基，使得心肌细胞线粒体形态结构的损害及细胞损伤，改变细胞膜的通透性，使得细胞膜脂质过氧化，从而导致NF-κB p65表达水平降低[22]。

总之，阿霉素诱导心脏损伤模型大鼠多伴随有超声心功能指标的异常与NF-κB p65表达水平下降，两者存在相关性。